β-葡聚糖酶活性測定

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1、β-葡聚糖酶活性測定β-葡聚糖是由葡萄糖單體通過β-1，3和β-1，4糖苷鍵連接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于單子葉禾本科谷實(shí)中的糊粉層和胚乳細(xì)胞壁中。β-葡聚糖酶屬于水解酶類，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷鍵，使之降解為小分子。由于在飼料中，大麥的β-葡聚糖含量較高，難以被單胃動物消化利用，而且對飼料中各種養(yǎng)分的消化利用具有明顯的干擾和抑制作用，成為麥類飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。在飼料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，促進(jìn)飼料中各種養(yǎng)分的消化和吸收利用，增進(jìn)畜禽健康。在啤酒生產(chǎn)中，添加

2、β-葡聚糖酶可以加快麥汁和啤酒的過濾速度、提高麥汁得率、增加可發(fā)酵糖的含量。此外，β-葡聚糖酶在造紙工業(yè)、日化工業(yè)等其它許多方面也有著廣泛的應(yīng)用，對β-葡聚糖酶的研究將越來越受到人們的重視。β-葡聚糖酶活力的測定方法主要有3種：還原糖測定法（分光光度法）、粘度測定法和底物染色法。其中還原糖測定法簡便實(shí)用，比較準(zhǔn)確，而且結(jié)果重復(fù)性好，是廣泛使用的一種酶活測定方法。其原理是：β-葡聚糖酶能將β-葡聚糖降解成寡糖和單糖，其具有的還原基團(tuán)在沸水浴條件下可與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中β-葡聚

3、糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色測定反應(yīng)液的吸光度值來計算還原糖的生成量，從而得出β-葡聚糖酶的活力。但在該測定方法的具體操作中存在一些影響酶活力測定結(jié)果的因素，本文即對還原糖法測定β-葡聚糖酶活力的幾個重要影響因素進(jìn)行研究，并得出最佳測定條件。1材料與方法1.1菌株與培養(yǎng)基1.1.1發(fā)酵產(chǎn)酶菌株黑曲霉（Aspergillusniger）A47菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。1.1.2固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮70g、米糠27g、NH4NO32.95g、微量元素液0.05ml、蒸餾水100ml，pH值5.0，121℃滅菌20min。微量元素液的組成

4、為：2mol/lHCl溶液5ml、FeSO42.5g、MnSO4·H2O0.98g、ZnCl20.83g、CoCl21.0g、蒸餾水100ml。1.1.3發(fā)酵培養(yǎng)條件250ml三角瓶裝10g培養(yǎng)基（干料計），接種量為每瓶0.5ml孢子懸液(1.0×107cfu/ml)，發(fā)酵溫度30℃，培養(yǎng)48h。1.2試劑與溶液1.2.1β-葡聚糖溶液準(zhǔn)確稱取0.7gβ-葡聚糖(Amresco)，加入5ml無水乙醇潤濕，再加入80ml緩沖液，同時緩慢加熱直至β-葡聚糖完全溶解，冷卻至室溫，用緩沖液定容至100ml，底物溶液4℃保存，2d內(nèi)用完。1.2

5、.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(10mg/ml)稱取烘干至恒重的無水葡萄糖1g，精確至0.1mg，用水溶解并定容至100ml。1.2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50ml于10ml容量瓶中，用水定容至10ml，蓋塞，搖勻備用。1.2.4DNS試劑稱取3，5-二硝基水楊酸10g，置于約600ml水中，逐漸加入氫氧化鈉10g，在50℃水浴中(磁力)攪拌溶解，再依次加入酒石酸鉀鈉200g、苯酚(重蒸)2g和無水亞硫酸鈉5g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至100

6、0ml，過濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7d后使用。1.2.5粗酶液的制備取5g固體發(fā)酵曲于250ml三角瓶中，加入緩沖液50ml，振蕩抽提1h，過濾離心去除孢子后，4℃保存?zhèn)溆谩?.2.6緩沖液乙酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖配制液見葉寶興主編《生物科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)》（2005）。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法按表1規(guī)定的量，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、緩沖溶液和DNS試劑于各管中（每管做3個平行樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時置于沸水浴中，反應(yīng)10min。取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25ml，蓋塞，混勻。在波長550nm處測量吸光度。以葡萄

7、糖量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。1.4酶活力測定方法取2支25ml刻度具塞試管，分別加入1.5ml0.7%β-葡聚糖底物溶液（由pH值5.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制），置55℃水浴中保溫5min。在其中一支試管中加入0.5ml稀釋酶樣，混勻，置于55℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min，加入3mlDNS試劑至兩支試管中，混勻。在另一支試管(空白管)中加入0.5ml稀釋酶樣，同時將兩支試管放入100℃水浴中反應(yīng)10min，取出置于冷水中冷卻至室溫，加水定容至25ml，蓋塞混勻，在550nm處測量酶樣對空白的吸光度，計

8、算酶活力。1.5酶活力計算標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=AX+B。式中：Y——吸光度；X——葡萄糖量(mg)；A——斜率；B——截距。式中：1000——mg與μg之間的換算系數(shù)；D——酶液稀釋倍數(shù)；180——葡萄糖分子量；0.5——測定