豬瘟病毒熒光定量pcr檢測方法的建立

《豬瘟病毒熒光定量pcr檢測方法的建立》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展。2009，30(5)：36—40ProgressinVeterinaryMedicine豬瘟病毒熒光定量PCR檢測方法的建立王云龍。，劉建營。，韓潔。，陳小科。，李玉林。(1．河南鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450121；2．廣東省畜牧技術(shù)推廣站，廣東廣州510500；3．河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001)摘要：通過RT-PCR方法克隆了豬瘟病毒(CSFV)5端非編碼區(qū)(UTR)的一段靶序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。同時根據(jù)GenBank中的靶序列設(shè)計(jì)了用于FQ_PCR的一對引物和一條IraqMan探針。通過條件優(yōu)化，以定量的1O倍系列稀釋

2、的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了CSFV檢測的熒光定量PCR方法。結(jié)果表明，該方法檢測靈敏度可達(dá)1．0×10?？截悾疞，線性范圍為1O?！?O。，達(dá)1O個數(shù)量級；對起始濃度為1．0×10。、1．0×10。、1．0×10拷貝／L的標(biāo)準(zhǔn)品的最終實(shí)際測得值(Ct)分別為l9．73、22．95和26．24；變異系數(shù)分別為0．61、1．77和1．18，均小于5，說明此方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。對陽性組織病料的檢測表明，該方法的檢測靈敏度高出常規(guī)PCR，與套式PCR具有相近的靈敏度。關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；熒光定量PCR；TaqMan探針中圖分類號：$852．6

3、51文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007—5038(2009)05—0036—05豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)廣泛應(yīng)用，它可以準(zhǔn)確的計(jì)算出組織中病毒的含量，是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)推測動物是處于發(fā)病階段還是亞臨床感染階段。因成員[1]，其基因組為單股正鏈RNA，長約12．5kb，此，我們將FQ-PCR技術(shù)用于豬瘟病毒的定量檢測，含一個大的開放閱讀框(ORF)，兩側(cè)為高度保守的通過特異性、敏感性和重復(fù)性驗(yàn)證，并與常規(guī)PCR、5和3非編碼區(qū)[2]。由CSFV引起的豬瘟在臨床上套式PCR(nPCR

4、)方法進(jìn)行比較，建立了豬瘟病毒主要表現(xiàn)為高熱稽留、出血梗死和死亡率高等特征。的定量檢測方法，為豬瘟病毒的早期診斷提供有力雖然我國應(yīng)用豬瘟兔化弱毒疫苗較好地控制了該病工具，同時也為豬瘟病毒的流行病學(xué)、致病機(jī)理和分的發(fā)生，但近年來，我國豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生子生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考和依據(jù)。了很大的變化，以溫和型、非典型豬瘟和母豬持續(xù)性1材料與方法感染引起的流產(chǎn)、死胎及新生仔豬發(fā)病、死亡為1．1主要儀器與試劑主【3]I，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，目前急需一ABIPrism7500熒光定量PCR儀，ABI2700種快速、特異、敏感的診斷方法用于該病的診斷和防普通PCR儀

5、。核酸蛋白分析儀，凝膠成像分析系治。統(tǒng)，高速離心機(jī)。RNA提取試劑盒，一步RT-PCR國內(nèi)外對CSFV的常用診斷方法有病毒分離、試劑盒，熒光定量PCR試劑盒，DNA凝膠回收試劑間接免疫熒光抗體(IFA)[6]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒，質(zhì)粒小量提取試劑盒，BamHI、H／ndⅢ、(ELISA)[7]、血清學(xué)方法、反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)Premix等均購自寶生物工程(大連)有限公司。(RT—RCR)等[8]。但這些方法都存在某些不足之TaqManPCR八聯(lián)管購自ABI公司。處，病毒分離耗時長，IFA檢測靈敏度不是很高；1．2病毒、質(zhì)粒和菌種ELISA和血清學(xué)方法只能檢測抗體，不適合早

6、期診CSFV分離自河南省某豬場的1份患病仔豬組斷；RT-PCR易污染等。近年來發(fā)展起來的熒光定織病料；pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有量PCR(FlourescentquantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR)技限公司；宿主菌DH5a為河南省生物工程技術(shù)研究術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表中心保存。達(dá)水平分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到收稿日期：2009-02—26作者簡介：王云龍(1962一)，男．河南洛陽人，高級工程師，主要從事生物工程技術(shù)研究。王云龍等：豬瘟病毒熒光定量PCR檢測方法的建立371．3標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備94℃預(yù)變性2min

7、；然后以94℃30S、56℃30S；1．3．1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中CSFV72℃1min進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10rain。反應(yīng)5端非編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對PCR引物：上游引物結(jié)束，取5LPCR產(chǎn)物用15g／L瓊脂糖凝膠電泳P1：5一ACGGAGGGACTAGCCGTAGTp3；下游鑒定產(chǎn)物。引物P2：5一CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC3。1．3．3PCR產(chǎn)物的克隆及酶切鑒定PCR產(chǎn)物用擴(kuò)增片段為238bp。引物由Invitrogen公司(上海)15g／L瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，用