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《panton—valentine殺白細胞素原核表達、純化及生物學活性鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、·6·安徽醫(yī)科大學學報ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2011Jan；46(1)Panton—Valentine殺白細胞素原核表達、純化及生物學活性鑒定常文嬌。，馬筱玲，沈繼龍，高朋，戴媛媛，張翠萍‘，周馨。，周文靜摘要目的原核表達金黃色葡萄球菌Panton—Valentine殺1材料與方法白細胞素(PVL)蛋白，并進行生物學活性鑒定。方法提取PVL陽性金黃色葡萄球菌DNA，利用PCR擴增LukF—PV和1．1實驗材料LukS—PV編碼基因，亞克隆入表達載體pET28a，轉化人大腸1．1．1質粒和菌株產(chǎn)PVL金葡菌菌株為本科室埃希菌(Ecolt
2、)BL21株，經(jīng)異丙基一B—D硫代半乳糖苷保存，屬ST30，SCCmecIV型。大腸埃希菌XL1．blue、(1PTG)誘導表達，純化后獲得可溶性的蛋白，Westernblot對DH5oL、表達宿主菌B[21(DE3)和表達載體pET28a其鑒定。并以人多形核粒細胞(PMNs)為靶細胞檢測其生物均由教育部省部共建重要遺傳病基因資源利用重點學活性。結果成功構建了LukF—PV和LukS—PV基因的表實驗室提供；克隆載體pMD18-T載體購自大連寶達載體，經(jīng)1PTG誘導和親和層析純化法獲得重組蛋白，Westernblot鑒定證實其為重組PVL蛋白。實驗表明該蛋白生物技術有限公司。具
3、有誘導人多形核粒細胞(PMNs)凋亡的作用。結論成功1．1．2主要試劑ExTaqs酶、限制性內切酶BamH地表達獲得了具有生物學活性的PVL重組蛋白，為PVL快I、XhoI、PCRMarker(DI2000)、低分子量蛋白質速檢測方法的建立和致病機制研究奠定基礎。Marker、鼠源性抗His抗體、HRP標記山羊抗小鼠主題詞殺白細胞素類／遺傳學；基因表達；細胞凋亡；葡萄IgG等均購自大連寶生物技術有限公司；硝酸纖維球菌，金黃色素膜(NC膜)為浙江四青生化材料廠產(chǎn)品；蛋白純自由詞Panton—Valentine殺白細胞素化試劑盒His·BandPurificationKit購自No
4、vagen公中圖分類號R341；R378．11；R394．2；R394．3司；人中性粒細胞分離液購自TBD公司；凋亡細胞文獻標識碼A文章編號1000—1492(2011)01—0006—05檢測試劑盒購自BenderMedsystems公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Panton—Valentineleukocidin(PVL)是金黃色葡1．2實驗方法萄球菌(金葡菌)分泌的一種雙組分(LukF—PV、1．2．1目的基因的獲得及原核表達載體的構建LukS—PV)成孔細胞毒素蛋白，是金葡菌重要的致病煮沸法制備PVL陽性金葡菌DNA模板，具體提取因子之一。PVL蛋白的兩種組分同時發(fā)揮生
5、物學活方法詳見參考文獻，PCR方法克隆分別擴增出不性，以七聚體形式在宿主細胞膜上形成孔道，損傷細帶有引導肽的LukF—PV和LukS．PV基因。(去引導胞膜，進而導致多形核白細胞(PMNs)，巨噬細胞和肽后的引物如下：LukF．PVP1：5．ACGCG．單核細胞的損傷，與重癥肺炎、皮膚和軟組織等感染壘!GCTCAAcATATCACAccTGTAAG一3，LukF—相關。近年來，產(chǎn)PVL金葡菌感染病例日益增PVP2：5一ACCG!壘TrAGCTCATAGGA3TI33'多，攜帶PVL基因的金葡菌毒性明顯增強，其引起TTCCTrAGATrG一3；LukS—PVP1：5一ACGC的感
6、染具有特殊的臨床癥狀，致死率高，逐漸成為一GATCCGAATCTAAAGCTGATAACAATATI"GAGAATA個嚴重的世界性問題。本研究旨在通過分子生物學TTG一3，LukS—PVP2：5ACCG壘TCAATrAT·技術，克隆表達純化獲得PVL蛋白LukF—PV和GTcc1]-rCACrITrAArI丫I1CATGAG一3)兩端分別引入LukS．PV組分，并進行生物學活性鑒定，為進一步的限制性內切酶BamHI和XhoI酶切位點。目的基研究和應用打下基礎。因分別與pMD18-T連接后，轉化入XL1．blue菌，2010—06—25接收挑陽性菌落擴增培養(yǎng)后，抽提質粒，測序正確
7、后，經(jīng)基金項目：安徽省2007年度科技攻關計劃(編號：07010302192)限制性內切酶BamHI和XhoI酶切，并與酶切后的作者單位：安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院檢驗科，合肥230001表達載體pET28a連接，轉化入表達宿主菌BL21。教育部重要遺傳病基因資源利用重點實驗室，合肥1．2．2重組質粒的誘導表達及純化將含有230032LukF—PV和LukS．PV編碼基因的菌液涂板，37~C活作者簡介：常文嬌，女，碩士研究生；馬筱玲，女，教授，碩士生導師，責任作者，E—mail：xiaolin
