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《紅松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及超低溫保存技術(shù)研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、**紅松體細(xì)胞胚胎發(fā)生和超低溫保存技術(shù)研究摘要本研究以紅松(Pinuskoraiensissieb.etzucc.)未成熟合子胚為外植體，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，研究了紅松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的各種影響因素、胚性愈傷組織在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)過程中的生理生化特性以及愈傷組織的超低溫保存，具體結(jié)果如下：1、分別于7月5日、7月15日、7月25日采收紅松未成熟合子胚，在添加2,4-D1.0、2.0、4.0mg/L，6-BA0.5、1.0、2.0mg/LGLH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。結(jié)果表明：未成熟合子胚的采樣時間(發(fā)育程度)、2,4-D和6-BA的濃度極
2、顯著影響紅松愈傷組織的誘導(dǎo)率。多重比較可知7月5日前后為紅松未成熟合子胚的最佳采樣時期，2,4-D2.0mg/L＋6-BA1.0mg/L為誘導(dǎo)紅松愈傷組織的最佳生長調(diào)節(jié)劑濃度組合，最高誘導(dǎo)率達(dá)43.33%。2、紅松胚性愈傷組織增殖階段的生長曲線基本呈“S”形，繼代20d后胚性愈傷組織增長趨于停滯。胚性愈傷組織生長率先快后慢，生長率最大值出現(xiàn)在繼代后第12d左右。研究結(jié)果表明了紅松胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)階段適宜的繼代頻率為每2-3周繼代一次。3、分別在GLH培養(yǎng)基上添加不同濃度的蔗糖、ABA、PEG來誘導(dǎo)紅松體細(xì)胞胚，結(jié)果表明不同濃度的蔗糖
3、、ABA對紅松體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)有極顯著影響，GLH＋蔗糖60g/L＋ABA20mg/L為誘導(dǎo)紅松體細(xì)胞胚胎的最佳培養(yǎng)基，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)數(shù)量達(dá)到47.5個/克愈傷組織，但PEG對紅松體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)并沒有顯著影響。誘導(dǎo)所得體細(xì)胞胚在萌發(fā)培養(yǎng)基(GLH＋蔗糖20g/L)上萌發(fā)率為73.3%。萌發(fā)后生成的體胚苗移栽成活率為64.3%。4、成熟胚誘導(dǎo)階段紅松胚性愈傷組織內(nèi)可溶性總糖與蔗糖含量變化趨勢相似，兩者都是0-5d迅速上升，5-15d下降，15-25d再上升，之后保持平穩(wěn)。可溶性蛋白質(zhì)含量在0-10d升高，10-20d降低，20d后又上升并有
4、分子量大小約為63.2和31.7KD兩種特異蛋白出現(xiàn)，這些特異蛋白可能作為體細(xì)胞胚胎形成的調(diào)控因子或結(jié)構(gòu)蛋白而起作用。糖分與蛋白含量在此階段均出現(xiàn)先上升、后下降再上升的變化趨勢，這這表明此階段胚性愈傷組織內(nèi)代謝旺盛，體細(xì)胞胚胎正在形成。5、紅松愈傷組織分別預(yù)處理0、12、24、36、48h后用6種不同的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行超低溫保存，保存3d后用4種不同方法解凍，結(jié)果表明：利用0.4mol/L山梨醇(Sorb)溶液將紅松愈傷組織預(yù)處理24h，以5%DMSO＋Sorb0.4mol/L為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行超低溫保存，采用20℃流水沖洗解凍，細(xì)胞的存活
5、率較高，經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)存活率達(dá)64.4％，這一研究結(jié)果為紅松愈傷組織中長期保存技術(shù)的研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：紅松，體細(xì)胞胚胎發(fā)生，生理生化特性，超低溫保存**本項(xiàng)研究受國家自然基金項(xiàng)目（NO.30571475）資助。SOMATICEMBRYOGENESISANDCRYOPRESERVATIONOFPINUSKORAIENSISSIEB.ETZUCC.ABSTRACTInthisthesis,immaturezygoticembryosofPinuskoraiensisSieb.etZucc.wereusedastheinitialexpla
6、ntsforsomaticembryogenesis.Thefactorsaffectingsomaticembryogenesis,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofembryogeniccallusaswellasthecalluscryopreservationwereinvestigated.Theresultswereasfollows:1.ImmaturezygoticembryosofPinuskoraiensisSieb.etZucc.sampledat3differ
7、enttimeswereculturedonGLHmediumwithdifferentconcentrationsof2,4-Dand6-BAtoinducecallus.Theresultsshowedthatthesamplingtime(maturity)ofimmaturezygoticembryos,concentrationof2,4-Dand6-BAhadasignificanteffectoninductionratesofcallus.TheresultofDuncan’smultiplerangetestconfi
8、rmedthatmoreefficientinductionwasachievedfromtheimmaturezygoticembryossampledonJuly5with2,4-D2.0mg/L+6-
