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1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文MicroRNA相關(guān)單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性肝癌遺傳易感性研究姓名：李玉春申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)指導(dǎo)教師：張建營201204中文摘要MicroRNA相關(guān)單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性肝癌遺傳易感性研究原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病原因不僅與環(huán)境暴露因素有關(guān)，同時(shí)個(gè)體的遺傳易感性也在其中起到了重要作用。近幾年來，科研人員發(fā)現(xiàn)了一種新的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，即microRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。該調(diào)控機(jī)制的核心內(nèi)容是microRNA種子區(qū)與相關(guān)基因mRNA上靶序列的Waston-C
2、rick堿基配對識(shí)別，該種識(shí)別能夠引起mRNA全部或者部分的翻譯抑制。MicroRNA調(diào)控網(wǎng)路中的SNPs主要包括以下三個(gè)部分：調(diào)控microRNA成熟的通路基因SNPs、microRNA基因自身的SNPs以及microRNA靶序列SNPs。MicroRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的SNPs可以影響成熟microRNA的表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)及其與靶基因的識(shí)別等方面，這種microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生的異常，最終能夠影響目的基因的表達(dá)和功能實(shí)現(xiàn)，從而改變個(gè)體的腫瘤易感性。在總結(jié)相關(guān)生物信息學(xué)資料的基礎(chǔ)上，結(jié)合中國人群特點(diǎn)，本研究選取了12個(gè)
3、microRNA調(diào)控網(wǎng)路中的SNPs，通過頻數(shù)匹配的病例對照研究，采用聚合酶鏈反應(yīng)．限制性片段長度多態(tài)性(PCR．RFLP)和等位基因特異PCR(AS．PCR)技術(shù)對這12個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，比較基因型頻率在原發(fā)性肝癌患者和正常對照之間的分布差異，探討影響河南漢族人群原發(fā)性肝癌發(fā)病的基因型、單體型以及基因．環(huán)境交互作用項(xiàng)，從而為原發(fā)性肝癌病因?qū)W研究和個(gè)體化防治提供思路。目的I．研究調(diào)控microRNA成熟的通路基因標(biāo)簽SNPs，具體包括DICERI基因rs3742330，RAN基因rsl4035和rs3803012，
4、GEMIN4基因rs7813、rsl045491、rs2291778、rs2740348和rs374474l位點(diǎn)及其與原發(fā)性肝癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)，并推測其可能的作用機(jī)制。2．研究microRNA前體SNPs，具體包括pre．miR．146ars2910164和prc-miR．196a2rsl1614913位點(diǎn)及其與原發(fā)性肝癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)，并推測其中文摘要可能的作用機(jī)制。3．研究mieroRNA靶序列SNPs，具體包括ILl6基因rsll31445位點(diǎn)和NOD2基因rs3135500位點(diǎn)及其與原發(fā)性肝癌遺傳易感性的關(guān)
5、聯(lián)，并推測其可能的作用機(jī)制。4．對上述SNPs進(jìn)行部分和整體聯(lián)合分析，探討影響原發(fā)性肝癌發(fā)病的基因型、單體型以及基因．環(huán)境交互作用。方法調(diào)控microRNA成熟的通路基因標(biāo)簽SNFs的選?。河蒆apMap(http／／www．hapmap．org)數(shù)據(jù)庫獲得中國人群(CHB)DICERl、RAN及GEMIN4基因的SNPs信息，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Haploview4．2軟件運(yùn)行，按照如下標(biāo)準(zhǔn)選取標(biāo)簽SNPs：r2>0．8，最小等位基因頻率(minorallelefrequency,MAF)設(shè)置為O．05。采用連鎖不平衡值(D’
6、值)置信區(qū)間法，將D’值95％CI在0．70—0．98的相鄰SNP歸入同一個(gè)單體型塊。從DICERl基因中篩選出1個(gè)標(biāo)簽SNPsrs3742330位點(diǎn)；從RAN基因中篩選出2個(gè)標(biāo)簽SNPs，GEMIN4基因中篩選出5個(gè)標(biāo)簽SNPs，rs2740348和rs3744741位點(diǎn)。分別為rsl4035和rs3803012位點(diǎn)；從分別為rs7813，rsl045491，rs2291778，MicroRNA前體SNPs的選?。簆re-miR．146ars2910164及pre．miR·196a2rsl1614913主要通過文獻(xiàn)回
7、顧選取。MicroRNA靶序列SNPs的選取：首先通過文獻(xiàn)回顧，總結(jié)肝癌特征所涉及到的96個(gè)易感基因，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載96個(gè)基因3’非翻譯區(qū)(3·untranslatedregion,3’UTR)的SNPs，利用miRanda、PieTar、TargetSeans和RNAfoldwebs髓'ver網(wǎng)站預(yù)測這些SNPs的microRNA靶標(biāo)和自由能，以與“種子”序列嚴(yán)格堿基互補(bǔ)配對的位點(diǎn)作為候選microRNA靶位點(diǎn)，最終在這些基因里找到lO個(gè)SNPs存在于潛在的miRNA靶位點(diǎn)中，挑選與肝癌關(guān)系密切，MAF>
8、0．05且結(jié)合自由能值(AAG)相對較大的2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，分別是ILl6基因的rsll31445和NOD2基因的rs3135500位點(diǎn)。采用頻數(shù)匹配的病例對照研究方法選取河南漢族560例原發(fā)性肝癌患者和560例正常對照，分別采用聚合酶鏈反應(yīng)．限制性片段長度多態(tài)性(PCR．RFLP)和等位基因特異PCR(AS．PCR)技術(shù)對上
