布魯氏菌三個(gè)外膜脂蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫原性實(shí)驗(yàn)

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1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文布魯氏菌三個(gè)外膜脂蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫原性實(shí)驗(yàn)姓名：馬長勝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：謝之景20120615山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要布魯氏菌病(brucellosis)是由布魯氏菌引起的人畜共患性傳染病，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康。布魯氏菌病是全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題，全世界有超過170多個(gè)國家和地區(qū)存在人和動(dòng)物的布魯氏菌病的流行。近年來，我國對(duì)布魯氏菌病進(jìn)行的監(jiān)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病疫情暴發(fā)形勢(shì)較為嚴(yán)峻，羊、牛布布魯氏菌病感染率上升較快，成為法定報(bào)告?zhèn)魅静?/p>

2、中發(fā)病數(shù)上升速度最快的疾病之一。布魯氏菌外膜蛋白在穩(wěn)定細(xì)菌外膜的結(jié)構(gòu)、適應(yīng)胞內(nèi)、外環(huán)境和抵抗胞內(nèi)殺菌機(jī)制等方面起著重要作用，與細(xì)菌的毒力有密切關(guān)系。外膜蛋白位于細(xì)菌的表面，參與細(xì)菌與宿主的相互作用，并且容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，激發(fā)免疫反應(yīng)。布魯氏菌的多種外膜蛋白都具有免疫原性，其中很大一部分是免疫保護(hù)抗原。因此，很多有關(guān)布魯氏菌致病機(jī)制和免疫反應(yīng)機(jī)制的研究都集中在外膜蛋白的研究上。．j島．。本研究選取布魯氏菌外膜三個(gè)脂蛋白為研究對(duì)象，體外克隆、表達(dá)、純化這三個(gè)外膜蛋白，分析其免疫原性，探討其作為診斷抗原和亞單位疫苗

3、候選蛋白的可行性。本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的布魯氏桿菌外膜脂蛋白0MPl0(GenBaIlk：L27995．1)、OMPl6(GenBank：JF918760．1)、OMPl9(GenBank：L27997．1)的基因序列，利用●托DNASTARPrimer5軟件分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。在三對(duì)引物上游都引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引入HindlII酶切位點(diǎn)。通過煮沸的方法提取了布魯氏菌疫苗株S19全基因組DNA，以全基因組DNA為模板，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增出了三個(gè)脂蛋白的基因片段j大小分別為

4、381bp、507bp、534bp。將擴(kuò)增的三個(gè)目的基因片段分別克隆入pEASY-T3，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a構(gòu)建了三個(gè)克隆載體：pEASY-T3／OMPl0，pEASY-T3／OMPl6，pEASY-T3／OMPl9。經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序比對(duì)正確后，分別提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BamHI和砌棚同時(shí)雙酶切重組克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-32a(+)質(zhì)粒，通過T4DNA連接酶將目的基因片段分別連接入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化入DH5a，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒：pET-32a／OMPl0、pET-32a／OMPl6、pET-

5、32a／OMPl9。經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后，分別將三個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E．coliBL21(DE3)。經(jīng)終濃度為lmM／LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS．PAGE、Western．blot鑒定和可溶性分析后，發(fā)現(xiàn)重組蛋白pET-32a／OMPl0、pET-32a／OMPl6、pET-32a／OMPl9為包涵體形式，采用Ni-NTASpinKit分別純化重組蛋白。用純化后的pET-32a／OMPl0與弗氏完全佐劑和不完全弗氏佐劑等布魯氏菌三個(gè)外膜脂蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫原性實(shí)驗(yàn)體積乳化后，采用背部皮下多點(diǎn)注射方式免

6、疫4—6周齡小鼠。共免疫三次，每次間隔2周，于第3次免疫后7天進(jìn)行心臟采血。然后用4"C離心機(jī)5000rpm／min，離心10mm，獲得抗血清。再以抗血清為一抗WestemBlot分析，觀測(cè)重組蛋白的免疫原性。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含有三個(gè)脂蛋白基因的克隆載體和表達(dá)載體。經(jīng)多次對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化后，大量表達(dá)并純化了三個(gè)重組融合蛋白，獲得了較高純度的重組蛋白，為進(jìn)一步研究蛋白的免疫原性和抗感染免疫功能奠定了基礎(chǔ)。然后將純化的包涵體蛋白pET-32a／OMPl0與弗氏佐劑乳化后，免疫昆明小鼠，獲得抗血清，并做了免疫原性

7、實(shí)驗(yàn)，證明OMPIO蛋白具有較好的免疫原性，為進(jìn)一步研究布魯氏菌外膜脂蛋白的功能和新型亞單位疫苗的候選蛋白的篩選奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：布魯氏菌；外膜脂蛋白；表達(dá)；純化；免疫原性山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractBrucellosisisazoonoticdiseasewhichcausedbytheBrucella,anditisseriousharmtothedevelopmentofanimalhusb岫andhumanhealth．Brucellosisisaworldwidepublichealth

8、probleminmorethan170countriesaroundtheworld．Inrecentyears，themonitoringresultsshowedthatbrucellosiswasmoreandmoreseriousinChina．SheepandcattlebrucellosisinfectionratesroseSOfastthatitbecameoneof