清肝方對(duì)d-galn誘導(dǎo)急性肝衰竭大鼠肝損傷及肝再生的影響及機(jī)制研究

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1、學(xué)位論文清肝方對(duì)D—GaIN誘導(dǎo)急性肝衰竭大鼠肝損傷及肝再生的影響及機(jī)制研究StudyonEffectsandMechanismsofClearingLiverPrescriptiononLiverInjuryandRegenerationinAcuteLiverFailureInducedbyD—GalNinRatS張揚(yáng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：亟±專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：論文提交時(shí)間：2Q!至生壘旦論文答辯時(shí)間：2Q12生5旦二。一二年五月2目的中文摘要IMIIIIIrllllllllrlUllllllllllllllillllY2520073觀察清肝方對(duì)D—GalN誘導(dǎo)急性肝衰竭熱毒血瘀

2、證大鼠肝損傷及肝再生的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討清肝方抗ALF的作用環(huán)節(jié)及機(jī)理。方法一選取健康清潔級(jí)雌性sD大鼠125只，體重180±209，隨機(jī)分為四組，即空白1、2組各10只，模型1、2組，美能1、2組及清肝方1、2組各20、15只。其中，1組用于造模后36h取血及肝組織標(biāo)本；2組用于觀察造模后96h大鼠的生存率。建模前12h禁食，除空白組外，其余各組用D—GalN1．49／kg單次腹腔注射建立大gALF熱毒血瘀證模型；空白組腹腔注射同等劑量的生理鹽水。造模前3天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每日灌胃1次，空白組和模型組給予蒸餾水10ml／kg／d灌胃，美能組給予成人等效臨床劑量1

3、5．6mg／kg／d，清肝方組給予成人等效臨床劑量29．79／kg／d。動(dòng)物自由飲食。以腹腔注射的時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，造模36h后取1組大鼠，經(jīng)股動(dòng)脈取血6ml，其中4ml置于干燥管中，另2ml置于枸櫞酸鈉抗凝管中，常規(guī)分離血清，一20*(2凍存待測(cè)。斷頸處死動(dòng)物后，沿腹正中線剖開(kāi)皮膚，分離出肝組織，取肝左葉相同部位存放于10％中性福爾馬林液固定，并取肝右葉置于冰塊上，以PBs緩沖液清洗干凈后，切取I．Ocmx1．Ocm×o．2cm大小的肝組織1塊，置于凍存管中，迅速用液氮速凍后轉(zhuǎn)運(yùn)至一70"(2冰箱備測(cè)。主要觀察96h內(nèi)各組大鼠的行為學(xué)變化及生存率；全自．動(dòng)生化分析法檢測(cè)

4、血清ALT、AST、TBil、ALB及CHE；全自動(dòng)血凝分析法檢測(cè)血漿PT；SABC免疫組化法檢測(cè)肝組織PCNA；RT-PCR熒光法檢側(cè)肝組織TLR4、NF一1cB、HMGBl及caspase-3mRNA表達(dá)水平。謔蟹耋口爿弋I、96h生存率：①模型組生存率為33．3％，美能組為46．7％，清肝方組為66．7％，三組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。②模型組、美能組及清肝方組估計(jì)平均生存時(shí)間分別為64．6、71．9、83．3h；log—rank檢驗(yàn)提示清肝方組累積生存率高于模型組(P<0．05)，而美能組與模型組、清肝方組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。2、肝功

5、能及凝血功能：模型組與空白組、清肝方組相比，在血清ALT、AST、TBiL水平及血漿PT水平方面明顯升高，而在血清ALB、CHE水平方面顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。美能組僅在ALT、AST及TBiL水平方面與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

6、，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。應(yīng)用美能或清肝方后，TLR4、NF-KB、HMGBI、caspase-3的表達(dá)量均顯著下降，且清肝方組下降幅度大于美能組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。5、肝組織PCNA表達(dá)情況：造模后PCNA在肝組織中的表達(dá)增加，而給予清肝方或美能灌胃可進(jìn)一步提高其表達(dá)水平，尤其是清肝方的作用明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)論1、清肝方可顯著減輕D—GalN誘導(dǎo)急性肝衰竭熱毒血瘀證大鼠肝細(xì)胞的損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生，改善肝功能及肝臟病理，延長(zhǎng)生存時(shí)間，降低死亡率。2、清肝方抗D—GaIN誘導(dǎo)急性肝衰竭大鼠模型的可能機(jī)制：①通過(guò)

7、下調(diào)肝組織TLR4表達(dá)，阻斷由相關(guān)病原分子、LPS等激活的TLR4／NF-1cB信號(hào)通路，減少前炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)，還可影響樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，抑制過(guò)亢的免疫反應(yīng)。②降低NF-KB在肝組織中的表達(dá)，可減少TNF-0【、IL-1、IL-6等信號(hào)的過(guò)度激活，中斷炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。③降低肝組織HMGBI表達(dá)水平，可阻斷HMGBl／TLR4／NF—KB信號(hào)通路。④下調(diào)caspase-3的表達(dá)水平，可抑制肝細(xì)胞的凋亡，還可減少因中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)而繼發(fā)的肝細(xì)胞壞死。⑤上調(diào)肝組織PCNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)殘留肝細(xì)胞的再生，促進(jìn)肝干細(xì)胞的分化，進(jìn)一步改善ALF大鼠的預(yù)后。關(guān)鍵