綿羊羊膜上皮細(xì)胞的分化潛能及在骨缺損模型治療中的應(yīng)用

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1、分類號S852.1學(xué)校代碼10129UDC號11.220學(xué)號2009301027綿羊羊膜上皮細(xì)胞的分化潛能及在骨缺損模型治療中的應(yīng)用Thedifferentiationpotentialofovineamnionepithelialcellsanditsapplicationintreatmentofboneinjurymodel申請人：朱雪敏學(xué)科門類：農(nóng)學(xué)學(xué)科專業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究方向：動物組織胚胎與發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：曹貴方教授論文提交日期：二〇一二年三月摘要羊膜上皮細(xì)胞（amnionepithelialcells，A

2、ECs）是由廢棄的胎盤羊膜衍生的具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。AECs不僅具有多向分化潛能，而且許多研究都證實(shí)其具有免疫豁免性，移植后不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，因缺乏末端轉(zhuǎn)移酶端粒，移植后不致瘤，再加上來源廣、易獲得，不存在倫理爭議等，而成為細(xì)胞研究工作者的研究熱點(diǎn)之一。應(yīng)用AECs進(jìn)行一些疑難癥的治療是臨床研究工作者的最終目標(biāo)。臨床應(yīng)用治療順利進(jìn)行的前提是以安全可靠的動物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)。目前，AECs的研究主要以人的為主，在臨床治療研究中以人AECs治療肝病、肺病、心臟病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疑難病癥。而綿羊AECs的研究在國內(nèi)尚未見

3、報(bào)道，國外的相關(guān)研究也極少。因此，本研究對綿羊AECs的分離培養(yǎng)、干細(xì)胞特性的鑒定、體內(nèi)分化及體外定向誘導(dǎo)分化進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。1.綿羊羊膜上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)參照人羊膜消化分離獲得原代細(xì)胞的方法，對綿羊羊膜的消化分離方法進(jìn)行了探索，最終選用胰酶替代物TrypLE消化綿羊羊膜分離獲得原代細(xì)胞，獲得的原代細(xì)胞活力高，純度好。細(xì)胞培養(yǎng)過程中選用了15%的胎牛血清濃度的培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，很好地維持細(xì)胞良好的生長態(tài)勢。在不同密度梯度培養(yǎng)情況下，通過觀察比較，確定了細(xì)胞接種的最適密度培養(yǎng)密度范圍。在最適密度培養(yǎng)范圍內(nèi)，進(jìn)行

4、細(xì)胞生長周期的觀察發(fā)現(xiàn)：綿羊AECs的潛伏期是1-2d，指數(shù)生長期是3-5d，以后為平臺期。通過細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)確定了細(xì)胞的凍存方案，采用DMSO作為凍存保護(hù)劑，F(xiàn)BS：DMSO=9:1的比列為凍存液，并且取-80℃到液氮的簡捷凍存途徑，有效地保存了綿羊AECs。2.綿羊羊膜上皮細(xì)胞的干細(xì)胞特性的鑒定采用細(xì)胞免疫熒光和RT-PCR技術(shù)分別檢測綿羊AECs的ES細(xì)胞表面標(biāo)志物Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81及干細(xì)胞全能性相關(guān)基因Oct-4、Sox-2、Nanog和Rex-

5、1等。檢測結(jié)果顯示綿羊AECs的Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的ES細(xì)胞標(biāo)志物均有表達(dá)。干細(xì)胞全能性相關(guān)基因Oct-4、Sox-2和Rex-1表達(dá)，而Nanog基因未見表達(dá)。檢測結(jié)果提示，綿羊AECs具有干細(xì)胞特性的多向分化潛能。3.綿羊羊膜上皮細(xì)胞在體外的定向誘導(dǎo)分化研究為了檢驗(yàn)綿羊AECs在體外的多向分化潛能，在一定條件下，利用一些外源因子誘導(dǎo)綿羊AECs向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞進(jìn)行定向分化。然后分別用細(xì)胞免疫熒光檢測和RT-PCR技術(shù)、細(xì)胞AKP活

6、性檢測、茜素紅染色、油紅O染色等方法進(jìn)行了誘導(dǎo)分化細(xì)胞的鑒定。結(jié)果顯示：①神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化28d后，細(xì)胞免疫熒光顯示神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物β-III-tubulin和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP均呈陽性表達(dá)；RT-PCR顯示nestin和β-III-tubulin和MAP-2等基因均有表達(dá)。②成骨誘導(dǎo)分化細(xì)胞AKP活性檢測顯示，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的第28d細(xì)胞AKP活性略有升高，第35d開始明顯高于對照組，而且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而繼續(xù)增高，誘導(dǎo)組和基礎(chǔ)培養(yǎng)組差異顯著；茜素紅染色有明顯的鈣化結(jié)節(jié)形成。③脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第42d

7、，油紅O染色觀察到有脂滴形成；細(xì)胞內(nèi)AKP活性檢測結(jié)果顯示，基礎(chǔ)培養(yǎng)組細(xì)胞AKP活性最高，各誘導(dǎo)組細(xì)胞AKP活性明顯低于基礎(chǔ)培養(yǎng)組。從上述鑒定中細(xì)胞的陽性及染色結(jié)果和誘導(dǎo)分化細(xì)胞的形態(tài)特征，可以推測本研究可以將綿羊AECs誘導(dǎo)分化為了表達(dá)β-III-tubulin陽性的未成熟神經(jīng)細(xì)胞及MAP-2陽性的成熟神經(jīng)細(xì)胞、GFAP陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，有鈣化結(jié)節(jié)形成的成骨細(xì)胞及有脂滴形成的脂肪細(xì)胞。4.綿羊羊膜上皮細(xì)胞治療兔橈骨缺損模型的研究國外有文獻(xiàn)報(bào)道，將綿羊AECs直接注射到綿羊體內(nèi)，來治療綿羊跟腱損傷的報(bào)道，且治療效果極佳

8、。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)我們獲得的綿羊AECs是否能夠在異種動物兔體內(nèi)進(jìn)行分化，從而達(dá)到類似的治療效果。手術(shù)制作30只兔橈骨13mm缺損模型，隨機(jī)分成3組，即高劑量組，低劑量組和對照組。將AECs處理后，按設(shè)定劑量通過靜脈注射進(jìn)行細(xì)胞移植。在細(xì)胞移植前、手術(shù)后、細(xì)胞移植后2周、4周、8周拍攝X光片，細(xì)胞移植后的2周、4周、8