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《骨髓源間充質(zhì)球的富集和向schwann細(xì)胞的誘導(dǎo)分化》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、博士學(xué)位論文論文題目骨髓源間充質(zhì)球的富集和向Schwann細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究生姓名施海燕指導(dǎo)教師姓名丁斐專業(yè)名稱人體解剖與組織胚胎學(xué)研究方向神經(jīng)發(fā)育與再生論文提交日期2012年11月骨髓源間充質(zhì)球的富集和向Schwann細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中文摘要骨髓源間充質(zhì)球的富集和向Schwann細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中文摘要目的施旺氏（Schwann）細(xì)胞在外周神經(jīng)的發(fā)育與再生中發(fā)揮重要作用，但是在嚴(yán)重的神經(jīng)損傷和變性疾病中Schwann細(xì)胞的來源明顯不足。Schwann細(xì)胞起源于短暫的胚胎神經(jīng)嵴結(jié)構(gòu)，不過在胎兒甚至成體
2、階段的多種神經(jīng)嵴源組織中仍存在遷移后神經(jīng)嵴源細(xì)胞（NCCs），NCCs是潛在的Schwann細(xì)胞來源。骨髓是神經(jīng)嵴源組織之一，雖然骨髓中NCCs的比例很低，但骨髓是容易獲取的組織來源。本研究旨在從出生后大鼠骨髓分離應(yīng)答表皮生長因子/成纖維細(xì)胞生長因子2（EGF/FGF2）的骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）亞群，在此基礎(chǔ)上富集成球生長的NCCs，即間充質(zhì)球（Mesenspheres），并將NCCs定向誘導(dǎo)分化，以獲得Schwann樣細(xì)胞。方法1.采用貼壁法從4~6w大鼠分離培養(yǎng)原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs
3、），常規(guī)傳代培養(yǎng)。通過有限稀釋法從P2代BMSCs分離出單細(xì)胞克隆亞群，細(xì)胞增殖速度最快的亞群作為對照亞群（BMSC-16）。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。2.利用NCCs應(yīng)答表皮生長因子/成纖維細(xì)胞生長因子2（EGF/FGF2）并成球生長的特性，通過重復(fù)性成球-貼壁兩步條件培養(yǎng)法從原代BMSCs分離出BMSCs亞群。可長期傳代培養(yǎng)至50代（P50）的亞群作為目標(biāo)亞群（BMSC-C2）。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。3.通過細(xì)胞長期增殖曲線、細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞周期流式（FCM）檢測、BrdU標(biāo)記檢測，比較目標(biāo)
4、亞群BMSC-C2與對照亞群BMSC-16的細(xì)胞增殖能力。4.通過無血清特定條件以克隆細(xì)胞密度對BMSC-C2與BMSC-16細(xì)胞進(jìn)行成球培養(yǎng)，比較細(xì)胞成球的數(shù)目和大小；通過對不同的3代細(xì)胞的比較（P53、P67和P80），分析長期傳代對BMSCs成球能力有無影響。5.通過傳代培養(yǎng)、核增殖抗原（PCNA）的染色、單細(xì)胞亞克隆的分離、細(xì)胞I中文摘要骨髓源間充質(zhì)球的富集和向Schwann細(xì)胞的誘導(dǎo)分化長期增殖曲線和細(xì)胞生長曲線，分析BMSC-C2亞群衍生的Mesenspheres的自我更新能力。6.通
5、過波形蛋白（Vimentin）、CD90、CD29、巢蛋白（nestin）、CD133和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體P75（P75NTR）的免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）染色，CD90、CD73、CD44、CD29、CD133和nestin的FCM檢測，分析間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和NCCs標(biāo)志蛋白在BMSC-C2、BMSC-16和Mesenspheres各亞群細(xì)胞的表達(dá)。7.通過熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-RT-PCR）檢測，比較MSCs標(biāo)志（thy1、nt5e、cdh2、vim、cxcr4、cd44、itg
6、b1、dhh、sox2、nes）和NCCs標(biāo)志（vim、cxcr4、cd44、itgb1、prom1、nes、dhh、sox10、sox2、msi1、wnt1、snail1、hes1、id2、itga4、hnk1、nfgr）在BMSC-C2、BMSC-16和Mesenspheres各亞群細(xì)胞的mRNA水平的表達(dá)。8.通過特定的條件誘導(dǎo)Mesenspheres向神經(jīng)系細(xì)胞分化，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，ICC檢測神經(jīng)元標(biāo)志β-微管蛋白-III（Tuj1）、神經(jīng)絲蛋白200（NF200）以及膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志
7、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)。9.通過特定的條件誘導(dǎo)Mesenspheres亞克隆向Schwann細(xì)胞分化，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，ICC檢測標(biāo)志蛋白S100β、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)、環(huán)核苷酸-3'磷酸水解酶（CNPase）和P75NTR在誘導(dǎo)的Schwann細(xì)胞（iSCs）的表達(dá)，通過計(jì)數(shù)細(xì)胞的S100β陽性率進(jìn)行純度鑒定和比較。10.通過特定的條件誘導(dǎo)Mesenspheres亞克隆N1向Schwann細(xì)胞分化，F(xiàn)Q-RT-PCR檢測NCCs標(biāo)志（wnt1、nes、ms
8、i1、prom1、hnk1、dhh、cxcr4、sox2、itgb1、id2、hes1、itga4、cd44、ngfr）和Schwann細(xì)胞標(biāo)志（cad19、cnp、foxo4、gfap、sox10、erbb3、ngfr）在誘導(dǎo)不同時間點(diǎn)（0h、12h、24h、48h）的細(xì)胞mRNA水平的表達(dá)變化。11.通過相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)的Schwann細(xì)胞(iSCs)與背根節(jié)（DRG）神經(jīng)元在體外共培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化，ICC檢測成髓鞘標(biāo)志蛋白髓磷脂堿性蛋白（MBP）和髓鞘相關(guān)糖蛋白（MAG
