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《水稻osdcl3b基因組織表達研究及沉默載體構(gòu)建》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、水稻OsDCL3b基因組織表達研究及沉默載體構(gòu)建摘要：采用熒光定量PCR方法分析了釉稻93—11根、莖、葉和花藥中0sDCL3b基因的表達，發(fā)現(xiàn)水稻不同組織0sDCL3b的表達量存在明顯差異，花藥中表達量最多，根中表達量最少。重點構(gòu)建了水稻0sDCL3b基因的沉默載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化粳稻中花11,獲得了轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株，為進一步研究0sDCL3b基因的功能打下了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：0sDCL3b基因；組織表達；載體構(gòu)建；基因沉默；水稻中圖分類號：Q943.2文獻標識碼：A文章編號:0439-8114(201
2、2)24-5788-03Dicer或Dicer—1ike(DCL)蛋白通過產(chǎn)生siRNA(si1encingRNA［和口匚RNA(microRNA)等小分子非編碼RNAs(non—codingRNAs,ncRNAs)［1］來調(diào)控其他相關(guān)基因的表達，進而影響真核生物的生長發(fā)育、抗病抗蟲性和逆境適應(yīng)性等［2—4］。在水稻中，已報道至少存在8個可能的DCL蛋白基因［5］o最初，Liu等［6,7］對OsDCLl和OsDCL4進行了功能分析，發(fā)現(xiàn)OsDCL1與miRNA的生物形成密切相關(guān)，缺失0sDCL1的生物個體在幼
3、苗期出現(xiàn)發(fā)育停滯現(xiàn)象，如植株矮化、葉片卷曲、根扭曲等現(xiàn)象。OsDCL4主要影響大小為21nt的siRNA的生物形成，與擬南芥同源基因AtDCL4不同的是，沉默或缺失OsDCL4既影響生物個體的營養(yǎng)生長，又影響生物個體的生殖生長，而AtDCL4僅影響生物個體的營養(yǎng)生長。隨后，Urayama等［8］的研究表明，敲除0sDCL2的轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源性dsRNA病毒的含量水平將明顯降低，植株表現(xiàn)為矮化和育性降低等。Wu等［9］證實，OsDCL3a與lmiRNA(1ongmicroRNA)的產(chǎn)生密切相關(guān)。最近，Song等
4、［10］進一步報道了OsDCL4、OsDCL3b和OsDCL1的功能；其中0sDCL3b的功能為首次報道，報道中僅指出了OsDCL3b的直接生物學(xué)功能是加工產(chǎn)生大小為24nt的小RNA,但這些小RNA究竟調(diào)控哪些相關(guān)功能基因的表達，以及相關(guān)功能基因的表達變化又如何影響轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育、抗病抗蟲性或逆境適應(yīng)性等尚未見報道?；谠诨u稻93—11花藥中獲得的0sDCL3b的全長cDNA序列(GenBank登錄號：DQ208406),采用熒光定量PCR方法研究了籾稻93-11不同組織部位0sDCL3b基因的表達差
5、異，并利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了OsDCL3b基因的沉默載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化粳稻中花11,獲得了轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株，為進一步研究OsDCL3b基因加工產(chǎn)生的各種小分子ncRNA究竟調(diào)控了哪些相關(guān)基因的表達、進而影響轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育、抗病抗蟲性或逆境適應(yīng)性等打下了重要的基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1植物材料、菌種與質(zhì)粒釉稻93—11和遺傳轉(zhuǎn)化所用材料粳稻中花11種子均由南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院植物遺傳研究室保存。用于基因沉默的質(zhì)粒pYL為改造的RNAi-Ubi[11],由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀
6、光教授惠贈。大腸桿菌TopiOF'、農(nóng)桿菌EHA105由南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院植物遺傳研究室保存。1.1.2主要試劑DL2000DNAMarker、PCR反應(yīng)所用DNA聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，植物RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII、M1uI和PstI購自Fermentas公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合
7、成。1?2方法1?2.1總RNA的提取和正向干涉片段的RT-PCR擴增按Invitrogen公司的TRIzo1試劑盒提取粕稻93-11花藥的總RNA后，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再用引物0sDCL3b-Si：5’-AATTGGATCCTCTAGACTCGAGGGTAAAGG-3z和OsDCL3b—Xi：5’一CCGGAAG2結(jié)果與分析2?10sDCL3b在粕稻93-11根、莖、葉和花藥中的表達結(jié)果2.2沉默載體的構(gòu)建結(jié)果2.3轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株的鑒定結(jié)果3討論前人的研究結(jié)果表明，粳稻0sDCL3b在營養(yǎng)組織中往
8、往低水平表達，在花器官和種子發(fā)育初期則高水平表達[5]□本研究結(jié)果進一步顯示，籾稻OsDCL3b基因在粘稻93-11的花藥中表達量最高，在其他組織中表達量均較低，尤其是在根中的表達量幾乎只有花藥中的50%。由此推測，OsDCL3b基因在水稻花藥中高水平表達可能是水稻穗子的生長發(fā)育所必需的，但有待于進一步試驗證實。最近，Song等［10］首次報道了OsDCL3b的直接生物學(xué)功能是加工產(chǎn)生24nt的小R
