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1、遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文阻斷吡娜地爾后處理大鼠心肌線粒體比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究姓名：李科申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：麻醉學(xué)指導(dǎo)教師：喻田；劉興奎20120521遵義匿學(xué)院碩士學(xué)位論文阻斷吡那地糸后處理文鼠心肌線粒體比較蛋鯉質(zhì)鯉塑墮窶阻斷吡那地爾后處理大鼠心肌線粒體比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中文摘要目的：建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察5．羥葵酸阻斷吡那地爾后處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心臟功能的影響，利用蛋白組學(xué)研究技術(shù)觀察心肌線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。方法：1．建立Langendorff大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型：將24只雄性sD大鼠隨機(jī)分為正常組(Nor)、缺血再灌注損傷組(I瓜)、吡那地
2、爾后處理組(Pina)、5．羥葵酸阻斷吡那地爾后處理組(5一HD+Pina)，每組8只；各組灌注方案：Nor組：持續(xù)灌注Kerbs．Henseleit緩沖液(K-H液)120min，無(wú)缺血再灌注損傷。I瓜組、Pina組、5-HD+Pina組，缺血前灌注K-H液平衡20min后，灌注4。CST．Thomas停跳液，使全心停跳缺血40min，分別按以下方案續(xù)灌：I／R組：灌注K-H液60min；Pina組：灌注K．H液前給予50pmol／L吡那地爾2min，繼之K—H液58min；5-HD+Pina組：依次灌注100gmol／L5．羥葵酸3min、50gmol／L吡那地爾2min、K-
3、H液55min。記錄各組平衡末和續(xù)灌末心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVDEP)、以及最大dp／dt等心功能的變化，并收集心室肌組織；2．差速離心及Nycodell_z密度梯度離心提取、純化大鼠心肌線粒體，并利用Westernblot檢測(cè)亞細(xì)胞器標(biāo)識(shí)物以驗(yàn)證其純度；3．Pina組與5-HD+Pina組心肌線粒體蛋白行雙向凝膠電泳(2．DE)、染色、凝膠掃描后獲得2-DE圖像，以PD．Quest8．0軟件分析各組差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，并將各蛋白點(diǎn)挖取、酶解、質(zhì)譜分析后獲得差異蛋白的譜圖；4．利用Westernblot回復(fù)驗(yàn)證關(guān)鍵差異蛋白的表達(dá)趨勢(shì)，以判斷2-DE結(jié)果的
4、可靠性。結(jié)果：1．利用Nycodenz密度梯度離心法進(jìn)一步的提高了線粒體的純度；2．平衡末各組間心功能無(wú)明顯差異，灌注末Nor組及Pina組的心功能明顯好于I／R組和5-HD+Pina組(P<0．05)，5-HD+Pina組與UR組間心功能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3．兩組蛋白進(jìn)行2-DE，得到聚焦良好、相似性高的圖像，在兩組膠上平均檢測(cè)出485+22個(gè)蛋白斑點(diǎn)；經(jīng)分析后得到9個(gè)差異大于2倍以上的蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜分析成功獲得一2一遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文阻蝴地鉑處哩叁墨堅(jiān)墜燮坐塾鱟魚(yú)墮絲鱟竺塑窒差異蛋白譜圖；4．通過(guò)分析，與Pina組比較在5-HD+Pina組表達(dá)下降的分別為：Spot5202、
5、5205(NADH脫氫酶1旺亞復(fù)合物10亞基，NDUFAl0)，Spot6001(ATP合酶O【亞基，ATPA)；表達(dá)升高的6個(gè)蛋白分別為：Spot2404(長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A脫氫酶，ACADL)，Spot5301(NADH脫氫酶1a亞復(fù)合物10亞基，NDUFAl0)，Spot5402(NADH脫氫酶鐵．硫蛋白2，NDUFS2)，Spot5503(乙醛脫氫酶2，ALDH2)，Spot6603(二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的組成部分，ODP2)，Spot6807(線粒體內(nèi)膜蛋白，IMMT)。其中Spot5202、5205、5301經(jīng)質(zhì)譜鑒定均為NDUFAl0，兩個(gè)表達(dá)下調(diào)，一
6、個(gè)表達(dá)升高。5．Westernblo回復(fù)驗(yàn)證，在5-HD+Pina組中NDUFAl0、NDUFS2及ALDH2較Pina組升高，ATPA較Pina組下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義儼<0．05)。結(jié)論：1．吡那地爾后處理能明顯改善大鼠心臟功能，而5．羥葵酸可部分拮抗其保護(hù)作用；2．5．羥葵酸阻斷吡那地爾后處理(線粒體敏感性K+通道的開(kāi)放被阻斷)，可導(dǎo)致：①心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注損傷引起ATPA表達(dá)下調(diào)，其原因可能是ATPA的轉(zhuǎn)運(yùn)尤其是跨膜過(guò)程受損；Pina可以維持線粒體內(nèi)ATPA的穩(wěn)定表達(dá)；②ACADL、NDUFS2、ODP2、IMMT、ALDH2表達(dá)上調(diào)；可能是由于線粒體內(nèi)H+增加、pH
7、升高、ATP合成減少、醛類物質(zhì)堆積等原因，促使這些蛋白質(zhì)發(fā)生了代償性的升高；③心肌缺血再灌注損傷可影響NDUFAl0的表達(dá)，期間NDUFAl0可能發(fā)生了剪切或修飾；就以上蛋白質(zhì)變化與mitoKAllP之間的確切關(guān)系，尚待進(jìn)一步深入研究。3．差速離心后再利用Nycodenz不連續(xù)密度梯度法離心，可獲取較高純度的心肌線粒體。關(guān)鍵詞：5．羥葵酸；吡那地爾；后處理；線粒體；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳；心肌——j一遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文阻斷吡那地爾后處理大鼠心肌線舷體比較蛋白質(zhì)組學(xué)的
