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《巢蛋白過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及巢蛋白過表達對肝臟增殖的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、南方醫(yī)科大學(xué)2009級博士學(xué)位論文巢蛋白過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及巢蛋白過表達對肝臟增殖的影響heestablishmentofnestinoverexpressiontransgenicmicandtheinfluenceofnestinoverexpressionontheliverproliferation課題來源：國家自然科學(xué)基金委與廣東省政府聯(lián)合重點基金(U0732006)專業(yè)名稱學(xué)位申請人指導(dǎo)教師答辯委員會主席答辯委員會成員論文評閱人外科學(xué)李振林高毅教授安靚教授2012年4月26日廣州博士學(xué)位論文巢蛋白過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及巢蛋白過表達對肝臟增殖的影響博士研究生：李
2、振林指導(dǎo)教師：高毅安靚摘要第一部分pbroad．nestin轉(zhuǎn)基因小鼠的制作背景Nestin是第六類中間絲蛋白，通常表達于發(fā)育中的神經(jīng)干／祖細胞：在胚胎發(fā)育過程中，逐漸被其它的組織特異性中間絲所取代。但nestin體內(nèi)的確切功能并沒有明確。Nestin的基因敲除小鼠表明：nestin+／-基因型的雜合子小鼠中，雖然nestin的表達量大幅減少，但并不引起可見的表型。說明ncstin的表達量可能并不影響小鼠的發(fā)育和生存。但純合子小鼠，且lJnestin-／-基因型的小鼠在胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)管發(fā)育缺陷并致死。Nestin缺失可引起神經(jīng)管細胞大量凋亡，且導(dǎo)致凋亡的作用和nestin的
3、細胞骨架功能無關(guān)。Ncstin也表達在神經(jīng)系統(tǒng)之外的其它地方，但nestin的基因敲除小鼠在其它含有nestin陽性細胞的部位并未發(fā)現(xiàn)明顯異常?？梢妌estin的體內(nèi)功能復(fù)雜。而nestin過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠將有助于闡明nestin的體內(nèi)功能。Nestin表達模式特別。其一般表達于分化未成熟的細胞，細胞分化成熟后其表達下降直至不表達。Nestin過表達能否維持細胞的增殖狀態(tài)?發(fā)育過程中過表達能否影響細胞的正常凋亡過程?Nestin表達部位也特別?！闱闆r下，nestin表達于細胞質(zhì)內(nèi)，但有些細胞又表達于核上。說明nestin可能與DNA或者核蛋白有相互作用，通過影響染色體的形態(tài)
4、或者結(jié)構(gòu)來影響其它基因的表達。Nestin過表達能否通過這個作用影響損摘要傷修復(fù)?為此，我們用顯微注射的方法來制作ncstin過表達的轉(zhuǎn)基因動物模型，以此來探討nestin的體內(nèi)功能。方法：以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U251的cDNA為模板，分3段擴增出nestin的全長DNA，并將其克隆入含有強啟動予rosa26的載體中，以期獲得較好的過表達。構(gòu)建好的載體酶切鑒定，測序，去除原核序列，純化；顯微注射前還要準備好幾種小鼠，包括供卵鼠，種雄，假孕母鼠，結(jié)扎公鼠等，然后將構(gòu)建好的載體用原核注射的方法注入受精卵內(nèi)。將受精卵植入假孕母鼠體內(nèi)。有些卵會發(fā)育成熟并出生。結(jié)果：構(gòu)建的載體酶切結(jié)果正
5、確。測序結(jié)果與Pubmed上公布的序列相符。共成功注射(注射后存活)273枚受精卵，回種入11只假孕母鼠體內(nèi)，出生小鼠34只。結(jié)論：成功構(gòu)建了表達載體pBroad3．nestin并將其導(dǎo)入到受精卵中。關(guān)鍵詞：nestin過表達顯微注射轉(zhuǎn)基因第二部分轉(zhuǎn)基因動物的檢測背景大多數(shù)外源基因在導(dǎo)入宿主動物基因組后，都能較“真實”的表達并使宿主動物產(chǎn)生特定的表型特征。然而，外源基因在轉(zhuǎn)基因動物及其子代中也有時發(fā)生拷貝數(shù)丟失和表達沉默的現(xiàn)象。究其原因，主要與位置效應(yīng)、外源基因的表觀遺傳學(xué)修飾和遺傳效率相關(guān)。其中，表觀遺傳學(xué)修飾是指DNA序列變化以外的可遺傳的基因表達改變，這種影響基因轉(zhuǎn)錄活性
6、而不涉及DNA序列改變的基因表達調(diào)控方式稱為表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前研究比較透徹的表觀遺傳學(xué)修飾作用機制包括DNA甲基化和組蛋白乙?；２粌H在不同組織中，即使是同一組織的不同細胞中，外源基因的表H博士學(xué)位論文達也有可能不同，這主要是由于不同細胞中外源基因甲基化水平不同導(dǎo)致的。另外，外源基因拷貝數(shù)在各組織器官中存在顯著差異，這可能與外源基因在不同組織器官中遺傳效率不同有關(guān)。由此可見，轉(zhuǎn)基因動物不同器官中外源基因的表達情況是有可能不同的。為了檢測轉(zhuǎn)入的nestin的表達情況，我們對主要器官進行了檢測。方法：先用PCR的方法篩選基因組中有外源基因(nestin)整合的小鼠。將有外源nest
7、in整合的小鼠傳代擴種。攜有外源基因的小鼠將外源基因穩(wěn)定傳至第3代之后用作實驗用鼠。小鼠分2組，每組3只，5．8周大小，雄性。麻醉后取材主要器官：心、肺、腦、腎等。用WesternBlot的方法檢i貝lJnestin的表達量。比較轉(zhuǎn)基因鼠和野生鼠nestin表達量(灰度值)之間的差別是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：PCR篩選出2個有外源基因整合的小鼠品系。(后面的檢測只選取了1個品系)。有外源基因整合的小鼠的腦、肺中nestin表達量較野生鼠為高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(肺：F=10．539，P=O．
