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《靶向tgf-βⅱ型受體的核酸適配子對(duì)tenon囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文靶向TGF--βⅡ型受體的核酸適配子對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究姓名：朱曉燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：謝琳201205第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文靶向TGF一13II型受體的核酸適配子對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究摘要背景：抗青光眼濾過性手術(shù)是治療青光眼的重要方法，但手術(shù)失敗率高達(dá)15％．30％，其主要原因是濾過泡瘢痕形成。雖然臨床上應(yīng)用5一氟脲嘧啶(5-fluorouracil，5一FU)、絲裂霉素C(mitomycinC，MMC)提高了濾過術(shù)的成功率，但仍
2、然存在某些嚴(yán)重的并發(fā)癥，如濾過泡滲漏、術(shù)后淺前房以及角膜毒性等。因此，尋求一種更為有效、安全的抗瘢痕藥物仍是研究的重點(diǎn)。各種研究表明轉(zhuǎn)化生長因子一p(Transforminggrowthfactior-[3，TGF—p)與組織瘢痕形成的關(guān)系最為密切。TGF—p有5個(gè)亞型，哺乳動(dòng)物只表達(dá)3個(gè)亞型，即TGF．p1、TGF—p2和TGF—p3，其中TGF—p2被認(rèn)為是與眼部瘢痕形成最密切的亞型。TGF一[1II型受體(Transforminggrowthfactior-13receptorII，TpRII)是TGF—p信號(hào)傳遞的始動(dòng)
3、受體，TGF—D首先與TpRII結(jié)合激活募集到TGF—pI型受體(Transforminggrowthfactior—preceptorI，TpRI)，并磷酸化TpRI，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TpRII磷酸化TpRI的GS區(qū)，使TpRI磷酸化是信號(hào)傳遞的關(guān)鍵步驟。因此，以T[3RII作為封阻靶點(diǎn)，干擾TpRII與TGF—B結(jié)合，阻斷TGF—D信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以達(dá)到抗纖維化的作用，這將對(duì)抗纖維化研究提供新的途徑。本課題組前期已經(jīng)成功建立SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnric
4、hment)篩選平臺(tái)，并從ssDNA隨機(jī)序列庫中篩選得到靶向TpRII胞外段蛋白的核酸適配子。然而適配子對(duì)TGF—B與其受體結(jié)合是否具有阻抑效應(yīng)，需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，從而篩選得到具有干擾效應(yīng)的適配子，為抗瘢痕治療的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的：本研究擬在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向TpRII的核酸適配子對(duì)TGF—B2生物學(xué)效應(yīng)的干擾作用，并初步探討適配子干擾效應(yīng)的機(jī)制，進(jìn)一步篩選得到具有封阻TGF—p2生物學(xué)作用的適配子。方法：1．取人眼Tenon囊組織貼壁法體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞(HumanTenonfibroblasts，第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文
5、HTFs)，第5代一第lO代細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。2．不同濃度TGF—p2(1、2、5、10、20ng／m1)誘導(dǎo)HTFs24h，以及TGF一132(2、5ng／m1)誘導(dǎo)HTFs不同時(shí)間(6、24、48、72h)，應(yīng)用Westernblot檢測細(xì)胞0【一SMA、pSmad2蛋白表達(dá)；共聚焦細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測a—SMA及F。actin定位表達(dá)。3．凝膠收縮實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度TGF一132(1、2、5、10ng／m1)作用下細(xì)胞收縮力的變化，以及適配子$58168與TGF一132(2ng／m1)共同作用下細(xì)胞收縮力的改變。4．核酸適配
6、子$58／68分別與TGF—B2共同作用HTFs24h，應(yīng)用Westernblot檢測細(xì)胞0【一SMA、pSmad2蛋白表達(dá)，共聚焦細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測伐一SMA及F．a(chǎn)ctin定位表達(dá)。結(jié)果：1．TGF一132(1、2、5、lO、20ng／m1)誘導(dǎo)HTFs24h后，q—SMA表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(尸<0．05)，10ng／ml、20ng／ml濃度組較2ng／ml、5ng／ml濃度組蛋白表達(dá)下降；濃度為2ng／mlTGF一132組0【一SMA表達(dá)在24．48h達(dá)到高峰。TGF—p2促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白F．a(chǎn)ctin表達(dá)，并能顯著
7、提高HTFs的收縮力。2．適配子$58具有明顯阻抑TGF—B2誘導(dǎo)HTFs表達(dá)c【．SMA、細(xì)胞骨架蛋白F—actin，并顯著抑制TGF一132介導(dǎo)HTFs的細(xì)胞收縮。不同濃度適配子組(20nM、100nM)作用之間無明顯差異。3．TGF—p2(2ng／m1)誘導(dǎo)HTFs表達(dá)磷酸化Smad2，作用在30rain～lh達(dá)高峰，2h開始出現(xiàn)pSmad2表達(dá)下降；適配子$58具有明顯阻抑TGF．B2誘導(dǎo)HTFsSmad2磷酸化水平以及pSmad2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位。4．適配子$68對(duì)TGF一132誘導(dǎo)HTFs的表型轉(zhuǎn)化無明顯的干擾作用。
8、結(jié)論：1．在體外實(shí)驗(yàn)中，TGF一132可誘導(dǎo)HTFs明顯表達(dá)0c．SMA，具有一定的濃度依賴性；并且2—5ng／mlTGF—p2濃度組對(duì)HTFs誘導(dǎo)0【一SMA表達(dá)作用達(dá)到一個(gè)峰值；表明TGF—p2可誘導(dǎo)HTFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。2．在體外實(shí)驗(yàn)中，靶向TGF．BII型受體
