農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化體系的建立及植酸酶基因的導(dǎo)入

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1、劉銀：農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化體系的建立及植酸酶基因的導(dǎo)入農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化體系的建立及植酸酶基因的導(dǎo)入摘要大豆是我國重要的油料作物和糧飼兼用作物，是植物蛋白的重要來源。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，許多學(xué)者通過基因工程的手段來改良大豆品質(zhì)、提高大豆產(chǎn)量。本研究以大豆的子葉節(jié)為外植體，探討了影響大豆再生效率的主要因素，建立了子葉節(jié)的再生體系；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將植酸酶(P^)，)基因?qū)胄×６怪校芯坑绊懫滢D(zhuǎn)化的主要因素，初步建立大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系，并獲得了經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因植株。主要工作和結(jié)果如下：l、大豆

2、子葉節(jié)再生體系的建立(1)種子消毒方法的確定：比較了3種不同種子消毒方法，氯氣消毒法對(duì)種子的傷害比較小，污染率低，適合大豆種子的消毒。(2)最適苗齡的篩選：不同苗齡的大豆子葉節(jié)誘導(dǎo)叢生芽能力存在顯著差異，無菌苗萌發(fā)4d時(shí)，叢生芽誘導(dǎo)率最高，為88．9％，因此子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的最適苗齡為4d。(3)大豆基因型的篩選：不同基因型的大豆再生能力差異較大，供試的5個(gè)不同基因型大豆，芽誘導(dǎo)率在24％．84％之間，其中小粒豆芽誘導(dǎo)率最高，因此將小粒豆作為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)材料。(4)6-BA濃度的確定：6-BA濃度直接影響無菌苗的萌

3、發(fā)及叢生芽的誘導(dǎo)，萌發(fā)培養(yǎng)基中添加1mg／L6-BA時(shí)無菌苗長勢(shì)最佳，芽誘導(dǎo)階段最適6-BA誘導(dǎo)叢生芽濃度為1．67mg／L。(5)生根階段IBA或NAA濃度的確定：生根階段添加IBA、NAA均可以顯著提高生根率，添加lmg／L的IBA最適合小粒豆不定芽的生根。2、Phy基因轉(zhuǎn)化大豆(1)確定了農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0．8，與子葉節(jié)外植體侵染30min，在含有25mg／LLA共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3d。(2)確定了草丁膦篩選的適宜濃度為5mg／L，并根據(jù)大豆子葉節(jié)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化特點(diǎn)，采用延遲篩選方法。(3)通過篩選，得

4、到抗性苗345棵，經(jīng)PCR檢測(cè)有5株為陽性，轉(zhuǎn)化率為1．45％。關(guān)鍵詞：大豆，子葉節(jié)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)，遺傳轉(zhuǎn)化，植酸酶基因ll揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文EstablishmentofAgrobacteriumtumefaciensmediatedsoybeantransformationsystemanddevelopingoftransgenicsoybeanwithPhygeneABSTRACTSoybeanisanimportantoilcrop，grainandforagecropinChina．Inrecenty

5、ears，thestrategyofgeneticengineeringhasbeenappliedinimprovingsoybearlqualityandenhancingsoybeanproduction．Inthisstudy,anefficientregenerationsystemofsoybeancotyledonarynodewasestablishedandoptimized．ThePhytase(Phy)genewastransferredintosoybeanwithAgrobacteriu

6、m-mediatedmethod．Themainfactorsinfluencingtransformationratewerediscussedandthetransformationsystemwasestablishedpreliminarily．ThepositiveplantswereobtainedandconfirmedbyPCR．Themainresultswereasfollows：1．Establishmentoftheregenerationsystemofsoybeancotyiedona

7、rynode(1)Selectionofthemethodforsoybeanseedssterilization：ThebeststerilizationmethodwasusingC12foritslowpollutionrateandlessdamageofsoybeanseeds．(2)Selectionofseedlingages：Therewerelargedifferencesofshootinductionfrequencyamongdifferentagesofgerminationseedli

8、ngs．4dgerminationseedlingswerechosentothetransformationforthehigestshootinductionfrequency,upto88．9％．(3)Selectionofgenotypes：Therewerelargedifferencesofregenerationfrequencybetweensoybean