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《農(nóng)桿菌介導高梁轉(zhuǎn)化體系的建立與bt（bacillusthuringiensis）抗蟲基因的導入》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、浙江大學博士學位論文農(nóng)桿菌介導高梁轉(zhuǎn)化體系的建立與Bt（Bacillusthuringiensis）抗蟲基因的導入姓名：張明洲申請學位級別：博士專業(yè)：生物物理學指導教師：夏英武2002.5.1摘要在優(yōu)化高粱再生系統(tǒng)和農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導法獲得了含密碼子優(yōu)化的殺蟲晶體蛋白(Bt)基因c∥lAb轉(zhuǎn)基因高粱。通過正交試驗和單因子試驗確定了高梁離體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，并對其多種影響因素進行研究。結(jié)果表明，高梁莖尖直接再生的培養(yǎng)基為：MS無機鹽+B5有機物+KTo．25mg／L+BAPO．25mg／L+IAAO．25mg／L+L-Asn200mg，L+抗壞血酸10
2、mg，L+PVP100mg／L+蔗糖309／L+瓊脂109／L；種子(胚)愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：MS(C)無機鹽+MS有機物+2,4一D3m#L+KTO．05mg／L+L-Pro50medL+水解酪蛋白500mg／L+PVP8rag／L+蔗糖309／L+瓊脂89，L：種子(胚)愈傷組織繼代培養(yǎng)基為：MS(C)無機鹽+MS有機物+2．4一D3mg／L+KT0．5mg／L+L·Asn200mg／L+L—Pro50m∥L+PVP100mg／L+抗壞血酸500rag／L+蔗糖309／L+瓊脂89／L；未成熟胚愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：MS無機鹽+MS有機物+2，4-D2mg／L+KTO．05
3、mg／L+T,米素0．05mg／L+L．Asn150mg／L+L—Pro700mg／L+水解酪蛋白lg／L+PVP8mg／L+抗壞血酸10mg／L+NH4N033．59／L+KH2P040．59／L+蔗糖209／L+瓊脂89／L：未成熟胚愈傷組織愈傷組織繼代培養(yǎng)基為：MS無機鹽+MS有機物+2，4-D2mg／I．+t,米素0．5mg／L+L—Asn150mg／L+L—Pro150rag／L+水解酪蛋白500mg／L+PVP8mg／L+抗壞血酸10mg／L+NH4N033．59／L+KH2P040．59／L+蔗糖209／L+瓊脂89／L；幼穗愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：Y14培養(yǎng)基(MS
4、+2，4--D2mg／L+玉,米素2．2mg／L+PVP8mg／L+抗壞血酸10mg／L+水解酪蛋白500mg／L+蔗糖309／L+瓊脂7．29／L)：幼穗愈傷組織繼代培養(yǎng)基為Y14+KT0．175mg／L。對不同外植體和不同基因型誘導產(chǎn)生愈傷組織的再生能力進行比較研究，結(jié)果表明，幼穗愈傷組織分化率最高，平均為77．2％；其次是莖尖，平均再生率為39．4％；未成熟胚愈傷組織平均分化率為21．7％；種子(胚)愈傷組織分化能力最差，分化率平均僅為l％。此外，不同基因型間的再生能力差異很大。以幼穗、莖尖和未成熟胚作外植體比較理想，可用于進～步的轉(zhuǎn)化研究。通過gus基因瞬時表達對農(nóng)桿菌介
5、導高梁轉(zhuǎn)化體系及其影響因子進行了系統(tǒng)性研究，獲得較高轉(zhuǎn)化頻率的條件為：(1)莖尖：預培養(yǎng)時間3d，在OD600值為O．5農(nóng)桿菌菌液中感染10min，共培養(yǎng)時間為3d；(2)未成熟胚和幼穗愈傷組織：預培養(yǎng)時間3d，最適農(nóng)桿菌菌液濃度OD600值為0．5--0．7，感染時間5--20min，最適共培養(yǎng)基pH值為5．2-5．6，最適共培養(yǎng)溫度為22--25。C，最佳共培養(yǎng)時間3d：(3)在共培養(yǎng)基、農(nóng)桿菌預培養(yǎng)基、懸浮培養(yǎng)基中添加AS100I．tmoI／L有助于提高轉(zhuǎn)化頻率：(4)在共培養(yǎng)基中添加PVP500mg／L，可防止外植體共培養(yǎng)后褐化死亡現(xiàn)象發(fā)生，促進轉(zhuǎn)化頻率的提高。，7首次研
6、究了不同抗生素的抑菌效果和對高梁離體再生培養(yǎng)反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)在農(nóng)桿菌介導高梁遺傳轉(zhuǎn)化時，選用250--500meJL的羧芐青霉素抑菌較為合適。不同高梁品種及外植體對潮霉素和卡那霉素的敏感性不同，但對潮酶素比卡那霉素更敏感。在篩選轉(zhuǎn)化體時，采用濃度為25．50mg／L潮酶素對莖尖和未成熟胚較為適宜，對愈傷組織則以50—75mg／L為宣。以幼穗愈傷組織為受體，在世界上第一次通過農(nóng)桿菌介導法將殺蟲晶體蛋白基因crylAb導入高梁品種115、ICS21B和5—27，共獲21個獨立轉(zhuǎn)基因細胞系，52株轉(zhuǎn)基因植株，平均轉(zhuǎn)化率為1．9％。經(jīng)GUS活性、PCR、Southern雜交分析表明此基因
7、已整合進高梁基因組中。Bt蛋白測定表明，crylAb基因能在轉(zhuǎn)基因高粱植株中表達，但不同轉(zhuǎn)基因植株及不同組織間表達量有所不同。室內(nèi)飼蟲試驗表明，轉(zhuǎn)基因高梁對大螟(Sesamiainferens)具有一定抗性。關(guān)鍵詞：Bt基因：農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化；高梁IIAbstractTransgenicsorghUlnplantscontainingacodon—modifiedinsecticidalBacillusthuringiensic(Bt)crylAbgenewereobtained
