熒光假單胞菌pseudomonas fluorescens p-72-10菌株對(duì)煙草黑脛病的生防機(jī)理研究

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1、西南大學(xué)博士學(xué)位論文熒光假單胞菌PseudomonasfluorescensP--72--10菌株對(duì)煙草黑脛病的生防機(jī)理研究姓名：董國(guó)菊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：周常勇20120605摘要摘要煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，由煙草疫霉P矗皿矽辦砌甜口，2f∞ff冊(cè)口PBredadeHaaIl引起的煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)上的一種毀滅性真菌土傳病害。該病原茵破壞性極強(qiáng)，煙株受害后易造成整株死亡，嚴(yán)重影響煙草生產(chǎn)。目前，生產(chǎn)上仍依賴于化學(xué)農(nóng)藥防治煙草黑脛病，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥，容易誘發(fā)病原菌產(chǎn)生耐(抗)藥性菌株，污染環(huán)境和破壞生態(tài)系統(tǒng)，

2、同時(shí)煙草是葉用經(jīng)濟(jì)作物，農(nóng)藥殘留會(huì)影響煙葉的品質(zhì)。隨著煙草及其制品向更加安全化方向發(fā)展的趨勢(shì)，尋找一種安全、無(wú)毒、經(jīng)濟(jì)、有效和可持續(xù)發(fā)展的病害控制途徑是當(dāng)務(wù)之急。生物防治由于具有經(jīng)濟(jì)有效、且對(duì)環(huán)境安全友好的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種最具潛力的、可替代化學(xué)農(nóng)藥的方法，現(xiàn)已成為植物病害防治研究的熱點(diǎn)。鑒于此，本文以分離自連作煙田健康煙株根際土壤的5個(gè)細(xì)菌菌株為研究對(duì)象，從中篩選出對(duì)煙草疫霉具有高效拮抗作用的菌株；進(jìn)一步圍繞該高效菌株對(duì)病原菌的抑制機(jī)制、其在煙草幼苗根部的定殖規(guī)律以及對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響等方面展開(kāi)系統(tǒng)深入的研究，初步探明該高效菌株的生防機(jī)理；

3、在此基礎(chǔ)上對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定并初步明確其最適的搖瓶培養(yǎng)條件。主要研究結(jié)果如下。高效拮抗煙草疫霉根際細(xì)菌菌株的篩選5個(gè)供試菌株中，除P一70—3菌株外，其余4個(gè)菌株對(duì)煙草疫霉均有很強(qiáng)的平板拮抗效果，且5個(gè)供試菌株的胞外代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌也表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。其中，P．72．10菌株的拮抗效果和抑菌作用最強(qiáng)，平板對(duì)峙培養(yǎng)中抑菌帶半徑達(dá)13．0mm，相對(duì)抑制率為68．57％；其胞外代謝產(chǎn)物粗提液對(duì)病原菌的抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)，分別為24．92％(10。3)、27．18％(10。2)、39．84％(101)和46．03％(原液)，且與對(duì)照相

4、比差異顯著瀘<0．05)。P-72—10菌株對(duì)煙草黑脛病的溫室控病效果該菌株的帶菌培養(yǎng)液灌根處理煙草幼苗后，能減輕煙草植株的發(fā)病率和降低病情指數(shù)；其對(duì)抗病和感病品種的控病效果表現(xiàn)出一定的差別，相對(duì)防效分別為53．57％和66．37％，與對(duì)照處理相比均達(dá)到差異顯著水平(尸<0．05)。P-72一10菌株對(duì)煙草疫霉的抑制機(jī)制該菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能抑制煙草疫霉菌絲的生長(zhǎng)，相對(duì)抑制率達(dá)到32．94％。顯微觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照菌絲形態(tài)飽滿，細(xì)胞壁光滑，胞質(zhì)均勻透明，分支正常：而平板對(duì)峙培養(yǎng)中受抑制菌落邊緣的菌絲形態(tài)發(fā)生畸變，其菌絲不正常的分支增多，菌

5、絲頂端細(xì)胞畸形生長(zhǎng)，并在菌絲的頂端或中間均有泡囊形成；部分菌絲干癟皺縮，原生質(zhì)滲漏；還有部分菌絲出現(xiàn)扭曲集結(jié)的現(xiàn)象。該菌株的菌體懸浮液和無(wú)菌濾液均能誘發(fā)病原菌菌絲形態(tài)發(fā)生類似的畸變現(xiàn)象。該菌株能產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶和嗜鐵素等抗菌物質(zhì)。P一72．10菌株在煙草根部的定殖規(guī)律該菌株對(duì)抗生素利福平敏感，以利福平為標(biāo)記抗生素，經(jīng)不同濃度的利福平逐級(jí)選擇壓力誘導(dǎo)后，最終獲得抗利福平(300ug／mL)的突變菌株P(guān)一72-10：Rif。該突變菌株的培養(yǎng)性狀及對(duì)病原菌的拮抗能力與原始菌株無(wú)差異。通過(guò)種子細(xì)西南大學(xué)博士學(xué)位論文菌化，該突變菌株能成功地定殖于

6、煙草幼苗的根部，其在根部的定殖動(dòng)態(tài)呈現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)；種子萌發(fā)出苗28天后，在煙草幼苗的根部仍能檢測(cè)到P．72．10：Rif菌株，其定殖量維持在104cfl噸這一穩(wěn)定的水平。掃描電鏡定性觀察發(fā)現(xiàn)P．72．10：Rif菌株在煙草幼苗根表不同部位的定殖分布呈現(xiàn)宏觀不均勻性，根基部分布的菌體數(shù)量多于根中部，而根尖部分的細(xì)菌菌體數(shù)量最少。P一72—10菌株對(duì)煙草的促生效果及作用機(jī)制煙草種子經(jīng)P．72．10菌株不同濃度的培養(yǎng)液浸種處理后，能促進(jìn)幼根的伸長(zhǎng)，其中，以101濃度促生效果最好，根長(zhǎng)為0．53cm，而對(duì)照根長(zhǎng)為O．47cm，與對(duì)照相比，

7、增加了12．76％，且差異顯著妒<0．05)；且種子的可溶性蛋白含量增加，總淀粉酶活性升高。培養(yǎng)液灌根處理煙草幼苗后，也能促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)及對(duì)N、P、K的吸收；增強(qiáng)光合效率、提高葉綠素含量；幼苗中丙二醛的積累量降低，與煙草植株抗性相關(guān)的防御酶(PPO、POD、PAL、幾丁質(zhì)酶和p．1，3．葡聚糖酶)活性升高，而各種防御酶活性的變化趨勢(shì)不一致，其活性高峰出現(xiàn)時(shí)間與數(shù)量也有差異。P-72·lO菌株的鑒定該菌株在King’sB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，且能產(chǎn)生水溶性的黃綠色熒光色素：為革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體桿狀、大小(8．1．16．2)×(1．8—4．8

8、)pm，單端生鞭毛，不形成芽孢。其最適生長(zhǎng)溫度為30℃；不耐鹽；能利用檸檬酸鹽和丙酸鹽。接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性，氧化酶反應(yīng)陽(yáng)性，精氨酸雙水解酶反應(yīng)陽(yáng)性，苯丙氨酸脫羧酶反應(yīng)陰性，脂酶反應(yīng)陰