α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定方法

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1、2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定方法2.2.1.1反應(yīng)溶液的制備（1）配制底物PNPG溶液：精確稱取0.3766gPNPG，加適量0.1mol/L磷酸緩沖液（pH為6.8）溶解，再用容量瓶準(zhǔn)確定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。將母液分別稀釋成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7個(gè)不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。（2）配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：將凍干酶粉（酶活力為14u/mg）用0.01mol/L磷酸緩沖液（pH為6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再將酶液分別稀釋，配制成0.

2、1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，備用。（3）配制DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液（抑制劑）：精確稱取0.0010gDNJ標(biāo)準(zhǔn)品，用容量瓶準(zhǔn)確定容到10mL，配制成1000μg/mLDNJ標(biāo)準(zhǔn)母液。將母液分別稀釋成、1、5、10、20、40、60μg/mL六個(gè)不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。（6）0.2mol/L的Na2CO3：稱取2.16gNa2CO3于燒杯中，加入適量蒸餾水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，備用。2.2.1.2PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取0.0278g對(duì)硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸緩沖液（pH為6

3、.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸餾水將其母液稀釋成濃度分別為1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取100μl上述標(biāo)準(zhǔn)液，各加入150μL0.2mol/L的Na2CO3，混勻1min，再于405nm處測(cè)定其吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=128.13x+0.3579(R2=0.9998)，其中y為濃度，x為吸光值。2.2.1.3α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定測(cè)定方法參照MasaoHattori等試驗(yàn)條件，并做調(diào)整。實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組、樣品空白組和樣品組，各反應(yīng)物按表中劑量在9

4、6孔板中進(jìn)行加樣，每組3個(gè)平行。按表依次加入PBS緩沖液、抑制劑溶液和底物，混合均勻，于37℃水浴保溫10min，結(jié)束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混勻，于37℃水浴反應(yīng)20min，結(jié)束后加入150μL0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反應(yīng)。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解產(chǎn)生葡萄糖和PNP，PNP在405nm處有最大吸收，其測(cè)定其吸光度，根據(jù)公式便可計(jì)算出各樣品α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50值。3公式表4各反應(yīng)物添加計(jì)量和順序（單位：μL）Table4Therespectivereactantsaddmeasur

5、ementandsequence(Unit:μL)試劑空白組對(duì)照組樣品空白組樣品組PBS溶液80706050抑制劑002020PNPG底物20202020充分混勻，37℃下孵化10min酶溶液010010充分混勻，37℃下反應(yīng)20min碳酸鈉1501501501502.2.2單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)以底物濃度、酶濃度、酶促反應(yīng)時(shí)間和添加順序?yàn)榭疾煲蛩兀訢NJ的α-葡萄糖苷酶抑制率為衡量指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。固定反應(yīng)順序?yàn)橐种苿?酶再加底物、底物濃度為2.0mmol/L，酶濃度0.3u/mL，緩沖液pH為6.80，反應(yīng)時(shí)間為20min。2.2.2.

6、1反應(yīng)物添加順序分別考察如下三種不同的反應(yīng)順序?qū)σ种苹钚缘挠绊?。a、抑制劑+底物→37℃溫育10min→+酶，反應(yīng)20min→碳酸鈉終止反應(yīng)→測(cè)定b、抑制劑+酶→37℃溫育10min→+底物，反應(yīng)20min→碳酸鈉終止反應(yīng)→測(cè)定c、底物+酶→37℃溫育10min→+抑制劑，反應(yīng)20min→碳酸鈉終止反應(yīng)→測(cè)定2.2.2.2底物濃度選DNJ和拜唐蘋為抑制劑，以其α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，考察0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mmol/L這5個(gè)不同梯度的底物對(duì)抑制活性的影響。2.2.2.3酶濃度選DNJ和拜唐蘋為抑制劑，以其α-葡萄糖苷

7、酶抑制率為指標(biāo)，考察0.1、0.3、0.5、0.7、0.9u/mL5個(gè)不同濃度的酶對(duì)抑制活性的影響。2.2.2.4緩沖液pH選DNJ和拜唐蘋為抑制劑，以其α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，分別考察不同pH6.6、6.8、7.0、7.2和7.4的緩沖液對(duì)抑制活性的影響。32.2.2.5反應(yīng)時(shí)間選DNJ和拜唐蘋為抑制劑，以其α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，考察10、20、30、40和50min不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)抑制活性的影響。參考文獻(xiàn)[1]MaCM,HattoriM,DaneshtalabM,etal.Chlorogenicacidderivativesw

8、ithalkylchainsofdifferentlengthsandorientations:potentalpha-glucosidaseinhibitors[J].JMedChem,20