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《菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)k562細(xì)胞分化及其對p53基因表達(dá)的影響》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、第38卷第1期廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)Vol.38No.11999年1月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Jan.1999菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化及其1對P53基因表達(dá)的影響11221顏青陳瑞川郭大勇張錚楊善民12(廈門大學(xué)抗癌研究中心廈門大學(xué)生物學(xué)系廈門361005)摘要為進(jìn)一步證實(shí)菠蘿蛋白酶對腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用,采用形態(tài)觀察計(jì)數(shù)、血紅蛋白定量測定、發(fā)光法測定細(xì)胞吞噬能力和Northern原位雜交法觀察和檢測了菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化及其p53基因表達(dá)變化.結(jié)果顯示,菠
2、蘿蛋白酶可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系和粒/巨噬系兩個(gè)方向分化;在菠蘿蛋白酶作用下,p53基因于給藥后8h轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng),24h達(dá)高峰,此后又下降,其時(shí)相變化先于分化發(fā)生.這些結(jié)果提示p53基因在Bromelain誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化過程中可能起啟動(dòng)分化的重要作用,有關(guān)機(jī)制尚待深入研究.關(guān)鍵詞誘導(dǎo)分化,菠蘿蛋白酶,K562細(xì)胞中國圖書分類號Q2.24腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化和分化治療已被證明是一種較有前途的腫瘤治療新手段,但有關(guān)菠蘿[1]蛋白酶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的研究報(bào)道較少.菠蘿蛋白酶(Bromelain,E.C.4.3.22.3)是從菠蘿中分離純化的
3、蛋白水解酶,屬巰基蛋白酶類.我們在文獻(xiàn)[2]中已報(bào)道了該酶對HL-60細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用.為進(jìn)一步證實(shí)菠蘿蛋白酶對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化是否有普遍性,本文選擇人紅白血病K562細(xì)胞株為對象,研究了菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分化方向及p53基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化等特征,以期初步探討菠蘿蛋白酶的抗腫瘤機(jī)理.1材料與方法1.1材料與試劑-5K562細(xì)胞株系本單位保存,以10細(xì)胞/mL接種于含10%小牛血清的RPMI1640(GIBCO)培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2培養(yǎng)傳代;菠蘿蛋白酶純化、激活及酶活力測定參照文獻(xiàn)[3],以國際單位(
4、IU)表示酶活力;地高辛DNA標(biāo)記檢測試劑盒購自寶靈曼,硝酸纖維膜為Amersham產(chǎn)品,p53(cDNA)由本單位周紅惠贈.1.2方法-21)給藥處理:K562細(xì)胞按8mL/瓶接種于10mL的培養(yǎng)瓶中,第2天加入3×10IU/mL(終濃度)的菠蘿蛋白酶,此后每天補(bǔ)加同量菠蘿蛋白酶,對照組僅加相應(yīng)量不含菠蘿蛋白酶的稀釋液.2)細(xì)胞計(jì)數(shù)及光鏡觀察:于血球計(jì)數(shù)板上常規(guī)苔酚藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活及死亡細(xì)胞;細(xì)胞經(jīng)1本文1998-06-15收到;福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目·104·廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)1999年常規(guī)Wright-Giemse染色后
5、,光鏡下觀察并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中分化細(xì)胞數(shù)計(jì)算分化指數(shù),實(shí)驗(yàn)均重復(fù)2次,取平均值.[4]3)血紅蛋白測定:參照臨床生化檢驗(yàn)測定血紅蛋白方法,以聯(lián)苯胺法測定分化細(xì)胞中6相對血紅蛋白含量,以吸光值表示,每樣品各取2×10個(gè)細(xì)胞,重復(fù)2次,取平均值.4)發(fā)光法測定分化細(xì)胞吞噬能力:按文獻(xiàn)[5]以酵母多糖為吞噬顆粒,魯米諾為冷光劑,液閃儀檢測吞噬能力,用發(fā)光強(qiáng)度(CPM)表示.5)探針標(biāo)記和Northern原位雜交分析:按試劑盒說明標(biāo)記p53cDNA探針,并按鮑家[6]駒的方法進(jìn)行Northern原位雜交分化.2結(jié)果2.1細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)觀察K5
6、62細(xì)胞經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后,于不同時(shí)間分別取樣對活細(xì)胞、壞死細(xì)胞及分化細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算各自所占百分率,由圖1可見隨處理時(shí)間延長,分化細(xì)胞比率增高,菠蘿蛋白酶對K562細(xì)胞具明顯抑制作用,但壞死率始終較低.光鏡下,分化細(xì)胞核/質(zhì)比下降,胞質(zhì)出現(xiàn)顆粒、空泡等分化標(biāo)志,胞核呈腎形、分葉、桿狀或無核(紅系),核內(nèi)有明顯的塊狀或粒狀異染色質(zhì)凝聚并出現(xiàn)粒/巨噬系分化細(xì)胞(圖2b)和紅系分化細(xì)胞(圖2c).圖2菠蘿蛋白酶對K562細(xì)胞形態(tài)的影響(處理3d,Wrigh-Giemsa染色,×1500)圖1菠蘿蛋白酶對K562細(xì)胞生長影響a.對照,b.粒/巨
7、噬系分化細(xì)胞,c.紅系分化a.生長曲線;b.分化曲線;c.壞死曲線細(xì)胞(箭頭示)Fig.1EffectofBromelainonK562cellFig.2EffectofBromelainonK562cellmorpholo-growthgy第1期顏青等:菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化及其對P53基因表達(dá)的影響·105·2.2菠蘿蛋白酶對K562細(xì)胞血紅蛋白合成的影響-2-2-2以1×10IU/mL、3×10IU/mL和5×10IU/mL菠蘿蛋白酶處理K562細(xì)胞3d,測定細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白相對含量,結(jié)果見圖3,可見菠蘿蛋白酶具有促進(jìn)K56
8、2細(xì)胞血紅蛋白的合-2成作用,尤以1×10IU/mL最強(qiáng).2.3菠蘿蛋白酶對K562細(xì)胞吞噬能力的影響-2以3×10IU/mL菠蘿蛋白酶處理K562細(xì)胞,分別于第3天和第4天取樣測定細(xì)胞吞噬功能,結(jié)果見圖4
