青稞c4h基因的克隆與組織表達分析

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1、萬方數(shù)據(jù)SichuanAgriculturalUniversityMasterDissertationCloningandTissueExpressionAnalysisofHvC4HGeneinQingke(HullessBarley)ByXiaojiaoLuoAdvisor：Prof．ZongyunFengMajor：BiochemistryandMolecularBiologyDirection：PlantMolecularBiologyMay,2014萬方數(shù)據(jù)論文獨創(chuàng)性聲明IIIIIIIIIIIIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

2、If√01219印本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生躲巧，卜崎關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明≯口／爭年6月乒日本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)

3、制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意四川農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。Ⅵ么論文不保密?？诒菊撐谋Ｃ埽谝荒杲饷芎筮m用本授權(quán)。(請在以上口內(nèi)劃“√”)J口，妒年Z月乒日．扣t≯年《只fB李髻卜j／弘湯名簽蜷隧究咖研導(dǎo)萬方數(shù)據(jù)摘要青稞(HordeumvulgareL．var．nudumHook．f)即裸大麥，是營養(yǎng)豐富的糧食作物，不僅富含蛋白質(zhì)和膳食纖維，更含有黃酮類化合物、Y．氨基丁酸等活性功能成分，其保健和醫(yī)療作用一直是大麥工作者研究的重點。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌抗腫瘤、延緩衰老、保護心腦血管等多種藥理功能，是人們理想的保健

4、物質(zhì)，植物中的天然黃酮類化合物主要有黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮等十幾類，大麥中的黃酮類物質(zhì)以黃酮醇為主。苯丙烷代謝途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一，其公共苯丙氨酸途徑下游的黃酮支路是植物黃酮合成的重要方式。肉桂酸．4．羥化酶(cinnamate．4．hydroxylase，C4H)是苯丙氨酸途徑第二步的關(guān)鍵酶，也被認為是該途徑的限速酶，它作為細胞色素P450酶蛋白家族參與苯丙烷代謝途徑的第一個成員，高效地催化苯丙烷代謝途徑中的第一個氧化反應(yīng)：在02和NADPH存在下將反式肉桂酸苯環(huán)的C4位羥基化生成對．香豆酸。為從分子水平了解青稞黃酮代謝途徑相關(guān)基因的作用，使

5、用RT-PCR結(jié)合同源克隆與RACE技術(shù)，用青稞材料“94．19．1”首次克隆出青稞肉桂酸．4．羥化酶(HvC4H)基因的cDNA全長序列，并使用實時熒光定量PCR對其在青稞胚乳發(fā)育5個時期里不同組織(子粒、莖部和葉片)中的表達水平進行了相對定量分析。主要結(jié)果如下：1．根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫里已知的禾本科單子葉植物C4H基因序列，通過序列比對在保守區(qū)域設(shè)計一對簡并引物，同源克隆得到HvC4H基因的保守片段。在保守片段的基礎(chǔ)上，采用RACE技術(shù)分別擴增出HvC4H基因的3’端和5’端序列并由序列拼接得到cDNA全長。結(jié)果表明，青稞肉桂酸一4．羥化酶基因的cDNA長為19

6、51bp，開放閱讀框(ORF)為1518bp(125—1642)，共編碼505個氨基酸；5’端非編碼區(qū)(5’．UTR)為124bp，3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)為309bp并包含了27bp的Poly．A尾。2．Blast序列比對結(jié)果顯示，HvC4H基因與二穗短柄草C4H基因相似度最高，為94％，與綠竹筍、柳枝稷、慈竹、粟米等C4H基因的相似度在92％，與水稻、玉米、垂尾桉、高粱等C4H基因的相似度在82％以上。HvC4H氨基酸序列包含了其CYP450酶蛋白家族已知的保守域和特征基序，包括血紅素結(jié)合域、5個特征性底物識別基序、萬方數(shù)據(jù)脯氨酸鉸鏈基序等，同時也識別到

7、C4H區(qū)別于其它CYP450蛋白的特有的氨基酸活性位點。3．采用實時熒光定量PCR技術(shù)，以在大麥胚乳發(fā)育期表達穩(wěn)定的13-actin和a-tubulin基因為內(nèi)參，檢測了HvC4H基因在青稞胚乳發(fā)育5個時期里子粒、莖部和葉片中的表達水平。結(jié)果顯示，HvC4H基因在青稞胚乳發(fā)育各個時期的子粒、莖部和葉片中的表達存在明顯的組織和時空差異性。莖部中的表達量剛開始最高，4天后急劇降低；葉片中的表達量在第8天達到最高；子粒中的表達量不高，但每個時期的差距較小。總的看來，在整個胚乳發(fā)育期，莖中HvC4H基因的表達量相對較高，而子粒中HvC4H基因的表達較低但保持穩(wěn)定水平。關(guān)鍵

8、詞：青稞(