沙門菌鞭毛蛋白作為新城疫疫苗佐劑的研究

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1、王靜：沙門菌鞭毛蛋白作為新城疫疫苗佐劑的研究沙門菌鞭毛蛋白作為新城疫疫苗佐劑的研究研究生：王靜導(dǎo)師：焦新安教授潘志明教授中文摘要新城疫是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的一種高度接觸性、急性、烈性和敗血性的禽類傳染病，對(duì)全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。目前一般使用活疫苗和滅活疫苗對(duì)新城疫進(jìn)行免疫預(yù)防控制，然而，在世界各地的商品雞群中，依舊存在新城疫爆發(fā)的狀況，表明現(xiàn)有的常規(guī)疫苗存在缺陷，因此，新型疫苗的研發(fā)勢(shì)在必行。本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NDVF48E8病毒株的F基因，與從鼠傷寒沙門菌表面

2、提取的鞭毛蛋白FliC混合，通過小鼠模型初步驗(yàn)證FliC的免疫佐劑效應(yīng)；此外，將FliC與商品化雞低毒力活疫苗(LaSota株)聯(lián)合免疫SPF雞并進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，探索FliC作為新城疫低毒力疫苗佐劑的可行性，從而為FliC作為新城疫疫苗佐劑的研究奠定基礎(chǔ)。1．鞭毛蛋白作為新城疫亞單位疫苗佐劑的研究通過PCR擴(kuò)增NDVF48E8病毒的F基因，大小為1659bp，再與畢赤酵母表達(dá)載體pPICZaA連接，將鑒定正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母GSll5感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組菌GSll5(pPlCZotA．F)。重組菌的最佳誘導(dǎo)條件為：使用終濃

3、度為0．5％(V／V)甲醇于28℃、250rpm的條件下連續(xù)誘導(dǎo)3天，SDS．PAGE顯示，F(xiàn)蛋白大小約為72KD，主要存在于胞內(nèi)。Westernblotting結(jié)果顯示，F(xiàn)蛋白能夠與小鼠抗NDVF48E8多抗血清和小鼠抗His單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明F蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。本研究采用酸裂解法從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的沙門菌ATCCl4028s(pTrc99a-fliC．WT)中提取鞭毛蛋白FliC。將其腹腔免疫C3H／HeJ小鼠，通過qRT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)脾臟中TLR5和不同細(xì)胞因子mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，注

4、射FliC1h和6h后，TLR5分子的mRNA水平分別上調(diào)了117和293倍(p0．05)。為檢測(cè)FliC作為佐劑的效果，將F蛋白與FliC揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文混合后免疫C3H／HeJ小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)+FliC蛋白組的IgG2a水平顯著高于IgGl(p

5、著高于IL．4(p<0．001)，而且F+FliC免疫組的IFN．丫含量顯著高于單獨(dú)F蛋白組(p<0．01)，說明免疫應(yīng)答類型偏向于Thl型，與IgG亞型檢測(cè)結(jié)果一致。通過檢測(cè)二免6周內(nèi)各免疫組抗體水平動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)+FliC免疫組和F+AI(OH)3免疫組抗體水平均在第21天達(dá)到最高，與單獨(dú)F蛋白組有顯著差異(p<0．01)，之后開始下降，抗體能維持1個(gè)月左右。表明鞭毛蛋白FliC作為佐劑可促進(jìn)機(jī)體的天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答水平。2．鞭毛蛋白與雞新城疫低毒力活疫苗聯(lián)合應(yīng)用的研究本研究將鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC與商品化雞

6、新城疫低毒力活疫苗(LaSota株)混合后滴鼻免疫1周齡的SPF雞發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IiC可以顯著提高NDV特異性的IgG抗體和HI抗體水平(矽<0．05)。用NDVF48E8攻毒后，PBS組的雞于第6天全部死亡，而LaSota+FIiC組和LaSota疫苗組的雞全部存活，因此本研究建立了基于NDVF48E8F基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，用于檢測(cè)攻毒后各組的排毒狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒后第3天的喉頭處以及攻毒后第5天的泄殖腔處，LaSota+FliC組的NDV病毒含量均顯著少于單獨(dú)LaSota疫苗組(p<0．05)，其余各個(gè)時(shí)間

7、點(diǎn)，無論是喉頭處還是泄殖腔處，LaSota+FliC組的NDV病毒含量也略低于單獨(dú)LaSota疫苗組，說明LaSota疫苗與FliC聯(lián)合免疫有助于抑制病毒在上呼吸道和腸道的復(fù)制和排毒。上述結(jié)果表明鞭毛蛋白作為L(zhǎng)aSota疫苗的佐劑，可增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答以及疫苗的保護(hù)效率，從而有助于抵抗新城疫強(qiáng)病毒的攻擊。本研究為鞭毛蛋白作為雞疫苗佐劑的深入研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：鞭毛蛋白，新城疫疫苗，天然免疫應(yīng)答，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCREfficacyofSalmonellaflagellinasapotentialadjuva

8、ntforNewcastlediseasevaccinesM．S．candidate：JingWangAdvisors：Prof．XinanJiaoProf．ZhimingPanAbstractNewcastledisease(ND)isahigh