核盤菌菌核形成相關(guān)蛋白ss-s12功能研究

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1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文核盤菌菌核形成相關(guān)蛋白Ss--S12功能研究姓名：余洋申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：姜道宏201206核盤菌菌核形成相關(guān)蛋白Ss-S12功能研究摘要核盤菌[Sclerotiniasclerotiorum皿ib．)deBary]是一種世界性分布的植物病原真菌，能夠侵染許多重要的農(nóng)作物，引起多種作物如油菜、向日葵和大豆等的菌核病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的損失。菌核是核盤菌越冬、越夏和繁殖的結(jié)構(gòu)，也是菌核病的重要初侵染來源，抑制菌核的形成將切斷菌核病的病害循環(huán)，因此研究核盤菌菌核形成的分子機理將為菌核病的防治提供新的

2、思路和線索。缺乏簡便穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系是核盤菌基因功能研究的重大障礙。本研究建立了以核盤菌菌絲為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，即直接將含有載體pTFSS的農(nóng)桿菌與新鮮的核盤菌菌絲塊在乙酰丁香酮存在的條件下進行共培養(yǎng)，2d后將菌絲塊丟棄并將共培養(yǎng)物置于含30pg／ml潮霉索的PDA培養(yǎng)基中進行選擇性培養(yǎng)，3d后獲得轉(zhuǎn)化子。該方法操作簡便，且轉(zhuǎn)化效率較穩(wěn)定，平均每個培養(yǎng)皿能獲得1-3個轉(zhuǎn)化子，為深入研究核盤菌菌核形成相關(guān)基因的功能建立了良好的平臺。本研究還發(fā)現(xiàn)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因在核盤菌轉(zhuǎn)化子的無性階段能穩(wěn)定遺傳，但在有性后代發(fā)生丟失。為深入探索核盤

3、菌菌核形成分子機理，本實驗室前期利用Illumina．Solexa技術(shù)建立了核盤菌菌絲生長和菌核形成階段的基因表達譜。分析該表達譜發(fā)現(xiàn)，Ss—S12(SSlG05917，XM001592945)的表達量在菌核形成階段升高了400倍，推測其可能與核盤菌菌核形成密切相關(guān)。本研究表明Ss．S12蛋白全長352aa，具有一個信號肽結(jié)構(gòu)和兩個PAN模塊，其同源蛋白僅僅出現(xiàn)在部分子囊菌中且均為功能未知蛋白。在核盤菌菌絲生長階段，少量Ss．S12蛋白分布于細胞壁和隔膜上；在菌核形成階段，Ss-S12表達量迅速升高，Ss．S12蛋白大量分布于細胞外加厚的細胞壁

4、上。Ss-S12的表達水平受c舢舊水平的抑制，而與環(huán)境pH無關(guān)。Ss-S12基因沉默轉(zhuǎn)化子維持細胞完整性的能力下降，但是菌絲生長和致病力與野生型菌株沒有差異。在菌核形成初期，Ss-S12沉默轉(zhuǎn)化子可以形成白色絨毛狀菌絲團，但是菌絲團不能固化和黑化并發(fā)育成熟的菌核，在菌絲團內(nèi)部菌絲排列疏松且細胞壁加厚不明顯，表明Ss．S12在核盤菌菌核形成過程中起著重要作用。對Ss．S12互作蛋白進行鑒定和功能研究將有助于理解其控制菌核形成和維持細胞完整性的作用機理。本研究表明3一磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，SSlG一07798)和沃魯寧體主要組成蛋白(Hex

5、l，SSlG一03527)可以與Ss-S12發(fā)生較強的直接相互作用，而轉(zhuǎn)錄延伸因子(EF．1a)則與Ss．S12存在著較弱的直接相互作用。GAPDH基華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆博士研究生學(xué)位論文因沉默轉(zhuǎn)化子只能形成白色絨毛狀菌絲團，而不能形成黑色的菌核，與Ss-S12沉默轉(zhuǎn)化子菌核形成表型相似；Hexl基因沉默轉(zhuǎn)化子保持細胞完整性能力下降，與$s-S12沉默轉(zhuǎn)化子菌絲表型相似，表明Ss．S12可能通過與GAPDH和Hexl的互作來控制核盤菌菌核的形成和維持細胞的完整性。本研究深入解析了核盤菌Ss．S12蛋白的作用及其機理，為揭示菌核形成的分子機制提

6、供了理論依據(jù)，也為菌核病的防治提供了重要線索：此外，本研究也為探索其它真菌中Ss．S12同源蛋白的功能提供了重要參考。關(guān)鍵詞：核盤菌；菌核；菌核形成；農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；Ss．S12,PAN模塊2核盤菌菌核形成相關(guān)蛋白Ss-S12功能研究ABSTRACTSclerotiniasclerotiorum(Lib．)deBaryisanotoriousfungalpathogenwithworldwidedistribution．Thisfungusmayinfectmanyimportantcrops，suchasoilseedrape，sunflow

7、er,soybean,andcauseSclerotiniadiseases．Sclerotiaarenotonlytheimportanttissueforbreedingandoversummerandwinterto＆sclerotiorum，butalsotheimportantsotR'ceofprimarilyinfectionforSclerotiniadiseases．Represstheformationofsclerotiamayinterruptthediseasecycleinducedby＆sclerotioruman

8、dresearchonthemolecularmechanisminvolvedsclerotialdevelopmentmayprovidesome