鏈孢粘帚霉hl-1-1寄生核盤(pán)菌菌核相關(guān)基因的研究

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1、分類(lèi)號(hào)：S432學(xué)校代碼：10758密級(jí)：公開(kāi)學(xué)號(hào)：09020060碩士學(xué)位論文鏈孢粘帚霉HL-1-1寄生核盤(pán)菌菌核相關(guān)基因的研究Mycoparasitism-associatedGenesofGliocladiumcatenulatumHL-1-1AssociatingwithSclerotiaofSclerotiniasclerotiorum研究生姓名張曄導(dǎo)師姓名及職稱(chēng)李世東研究員合作導(dǎo)師姓名及職稱(chēng)羅明教授學(xué)位門(mén)類(lèi)級(jí)別農(nóng)學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)植物病理學(xué)研究方向植物病害生物防治所在學(xué)院農(nóng)學(xué)院新疆·烏魯木齊二○一二年五月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)

2、下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育單位的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：時(shí)間：年月日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文檔，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)將學(xué)位論文的全部或

3、部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以公布（包括刊登）論文的全部或部分內(nèi)容。（保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）研究生簽名：時(shí)間：年月日導(dǎo)師簽名：時(shí)間：年月日本文是“863”計(jì)劃項(xiàng)目“微生物殺菌劑研究與產(chǎn)品創(chuàng)制”和轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)“抗大豆菌核病重要基因克隆及功能驗(yàn)證”（課題編號(hào)：2011AA10A205；2009ZX08009-0898）的部分研究成果鏈孢粘帚霉HL-1-1寄生核盤(pán)菌菌核相關(guān)基因的研究摘要鏈孢粘帚霉Gliocladiumcatenulatum是一類(lèi)分布廣泛的絲狀真菌，可以寄生多種植物病原真菌，具有較大的生防潛力。為研究鏈孢粘帚霉HL-1-1寄生核

4、盤(pán)菌菌核的相關(guān)基因，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)中序列進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)在菌核粉誘導(dǎo)條件下與寄生相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)，運(yùn)用RACE技術(shù)獲得了三條與寄生作用相關(guān)基因的序列全長(zhǎng)。從差異表達(dá)的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取504個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，去掉載體序列和小于100bp的序列，得到303條高質(zhì)量ESTs序列，平均長(zhǎng)度為423bp。經(jīng)過(guò)拼接后，獲得128條單值基因，其中包括23條重疊群（contiges）和105條單拷貝EST（singletons）。將得到的單值基因用BLASTx程序在NCBI的非冗余（NR）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析

5、，其中32個(gè)序列是已知功能基因，其中細(xì)胞色素P450、核糖體蛋白、血紅素加氧酶、脂滴包被蛋白以及內(nèi)切葡聚糖酶等都與機(jī)體在脅迫條件下的應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)；來(lái)源于不同物種的功能未知基因有85條；11條基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源性，代表新基因片段。為明確功能未知基因6-61、8-13和內(nèi)切葡聚糖酶基因8-20在菌寄生菌鏈孢粘帚霉HL-1-1寄生核盤(pán)菌菌核過(guò)程中的作用，本研究應(yīng)用SYBRGreenⅠ法對(duì)三個(gè)基因進(jìn)行real-timePCR法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)的定量監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明：未知功能基因6-61在菌核粉的誘導(dǎo)下表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，且在96h達(dá)到最低；基因8-13的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后

6、上升，在96h的表達(dá)量超過(guò)誘導(dǎo)前的表達(dá)量；內(nèi)切葡聚糖酶基因8-20的表達(dá)水平隨菌核粉誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在96h后表達(dá)量升高9倍。因此，相對(duì)表達(dá)量的定量監(jiān)測(cè)表明這三個(gè)基因參與了菌寄生過(guò)程。通過(guò)RACE技術(shù)獲得基因6-61、8-13和8-20的全長(zhǎng)序列，并通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行初步分析，其中基因6-61cDNA序列全長(zhǎng)1247bp（Genbank登錄號(hào)JQ811207），可以編碼129個(gè)氨基酸，與綠僵菌MetarhiziumacridumCQMa有較高同源性，屬于功能未知蛋白；基因8-13可編碼cDNA序列全長(zhǎng)1308bp（Genbank登錄號(hào)JQ8112

7、08），可以編碼176個(gè)氨基酸，與青霉菌PenicilliummarneffeiATCC18224有較高同源性，但屬于功能未知蛋白；基因8-20cDNA序列全長(zhǎng)1479bp（GenBank登錄號(hào)JQ728996），開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)1269bp，編碼423個(gè)氨基酸，與木霉Trichodermasp.SSL內(nèi)切葡聚糖酶的同源性高達(dá)94%，命名為eg8-20。采用同源重組原理構(gòu)建鏈孢粘帚霉HL-1-1功能未知基因8-13和內(nèi)切葡聚糖酶基因8-20的敲除載體，并成功獲得敲除轉(zhuǎn)化子UD-6和ED-3。以野生型菌株為對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表型分析，結(jié)果顯示：基因敲除轉(zhuǎn)化

8、子的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量與野生型無(wú)顯著差異