粉紅螺旋聚孢霉67-1菌寄生相關(guān)基因的篩選與功能研究

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1、密級：論文編號:中囯農(nóng)亞科學(xué)院學(xué)位論文粉紅螺旋聚孢霉67-1菌寄生相關(guān)基因的篩選與功能研究ScreeningandFunctionalAnalysisofMycoparasitism-RelatedGenesinClonostachysrosea67-1博士研宄生：孫占斌指導(dǎo)教師：李世東研宄員申請學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)博士專業(yè)：植物病理學(xué)研宄方向：植物病害防治培養(yǎng)單位：植物保護(hù)研究所研宂生院2015年5月密級:論文編號:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文粉紅螺旋聚孢霉67-1菌寄生相關(guān)基因的篩選與功能研究ScreeningandFunctionalAnalysisofMycoparasit

2、ism-RelatedGenesinClonostachysrosea67-1博士研究生：孫占斌指導(dǎo)教師：李世東研究員申請學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)博士專業(yè)：植物病理學(xué)研究方向：植物病害防治培養(yǎng)單位：植物保護(hù)研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationScreeningandFunctionalAnalysisofMycoparasitism-RelatedGenesinClonostachysrosea67-1Ph.D.Candidate：SunZhan-binSuperviso

3、r：Prof.LiShi-dongMajor：PhytopathologySpecialty:ManagementofplantdiseasesMay2015III摘要粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachysrosea，又名粉紅粘帚霉Gliocladiumroseum）是一類重要的菌寄生真菌，可以防治核盤菌、灰葡萄孢、鐮刀菌、立枯絲核菌等引起的多種植物真菌病害，同時還可以促進(jìn)作物生長，在溫室和田間試驗中廣泛應(yīng)用，具有巨大的生防潛力。但目前尚未見該菌寄生核盤菌菌核分子機(jī)制的報道。為闡明粉紅螺旋聚孢霉寄生菌核機(jī)制，篩選菌寄生相關(guān)基因，本研究以實驗室前期分離得到的一株高效粉紅

4、螺旋聚孢霉菌株67-1為材料，通過高通量測序技術(shù)分別獲得了67-1全基因組序列和寄生核盤菌菌核轉(zhuǎn)錄組信息，并研究了其脂滴包被蛋白基因per3、幾丁質(zhì)酶基因chi67和單加氧酶基因mono67在寄生菌核過程中的作用。本研究以67-1菌絲為材料，提取基因組DNA后進(jìn)行全基因組測序和分析。首先構(gòu)建了三個PE文庫（170bp，300bp和500bp）和1個MP文庫（5kb），采用IlluminaHiseq2500平臺進(jìn)行測序，測序覆蓋度大于150×，對序列進(jìn)行組裝后共得到1,552個contigs（重疊群），N50為99,664bp。這些contigs繼續(xù)組裝形成475個sca

5、ffolds，N50為569,489bp。最終組裝信息表明，67-1基因組大小為55.4Mb，G+C含量為49.2%。通過Fgenesh軟件分析，共預(yù)測出20,747個基因，與NCBINR數(shù)據(jù)庫比對，共有13,474個找到同源序列。67-1基因組序列信息為后續(xù)研究其與植物病原真菌的互作提供分子基礎(chǔ)。為研究粉紅螺旋聚孢霉67-1寄生核盤菌菌核分子機(jī)制并篩選寄生相關(guān)基因，本研究利用高通量測序和實時熒光定量PCR技術(shù)篩選獲得了67-1寄生核盤菌菌核不同時間間隔（8h、24h和48h）的差異表達(dá)基因。轉(zhuǎn)錄組測序和分析表明共得到26,351個單值基因，其中有18,525個基因可以

6、注釋到NR、KEGG、Swiss-Prot、GO和COG數(shù)據(jù)庫。在3個寄生時間段分別有3,217、4,025和4,274個基因上調(diào)表達(dá)，2,739、1,249和1,064個基因下調(diào)表達(dá)。對差異表達(dá)基因進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)菌核誘導(dǎo)下12個基因明顯上調(diào)表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄組分析一致，為研究粉紅螺旋聚孢霉寄生相關(guān)基因提供候選基因。內(nèi)參基因是應(yīng)用實時熒光定量PCR精確檢測基因表達(dá)量的基礎(chǔ)。為了篩選67-1寄生菌核過程中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究選擇了7個真菌常用的管家基因，18S核糖體蛋白基因(18SrRNA)肌動蛋白基因（Actin），β-微管蛋白基因（β-tubulin

7、），延伸因子基因（Elongationfactor），泛素基因（Ubiquitin），泛素結(jié)合蛋白基因（Ubiquitin-conjugatingenzyme）和甘油3-磷酸脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase），通過geNorm、Bestkeeper和Normfinder三個常用內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)延伸因子基因表達(dá)在不同階段均最為穩(wěn)定，可以用于67-1寄生核盤菌菌核相關(guān)基因的定量。本文通過67-1寄生菌核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，得到一個編碼脂滴包被蛋白的基因per3、一個