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1、碩士學(xué)位論文大葉藻ZomNHX2基因克隆分析與蘋(píng)果組培及耐鹽初步研究THECLONINGANDANALYSISOFZOMNHX2GENEFROMZOSTERAMARINAANDAPPLETISSUECULTUREWITHAPRELIMINARYSTUDYOFSALT-RESISTANCE盧美鳳哈爾濱工業(yè)大學(xué)2015年6月國(guó)內(nèi)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：Q37學(xué)校代碼：10213國(guó)際圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：582.261/.279密級(jí)：公開(kāi)理學(xué)碩士學(xué)位論文大葉藻ZomNHX2基因克隆分析與蘋(píng)果組培及耐鹽初步研究碩士研究生：盧美鳳導(dǎo)師：郭長(zhǎng)祿副教授申請(qǐng)學(xué)位：理學(xué)碩士學(xué)科：
2、生物學(xué)所在單位：海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院答辯日期：2015年6月授予學(xué)位單位：哈爾濱工業(yè)大學(xué)ClassifiedIndex:Q37U.D.C:582.261/.279DissertationfortheMasteralDegreeinScienceTHECLONINGANDANALYSISOFZOMNHX2GENEFROMZOSTERAMARINAANDAPPLETISSUECULTUREWITHAPRELIMINARYSTUDYOFSALT-RESISTANCECandidate：LuMeifengSupervisor：AssociatePro
3、f.GuoChangluAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchooloftheMarineScienceandTechnologyDateofDefence：June,2015Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文摘要大葉藻（Zosteramarina）屬于大葉藻屬（ZosteraL.）海洋高等被子植物，生活在含鹽量高達(dá)600mm
4、ol/L的海水中，被認(rèn)為耐鹽性很高，這表明大葉藻是研究耐鹽基因及耐鹽機(jī)理的絕佳材料。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽性方面具有重要作用，可以將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過(guò)量的Na+排出細(xì)胞或區(qū)隔化到液泡中，減少鹽離子特別是Na+對(duì)細(xì)胞的毒害，提高植物耐鹽性。本文從大葉藻中成功克隆出液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（ZomNHX2基因）并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)半定量RT-PCR技術(shù)探討該基因的組織表達(dá)特異性。建立蘋(píng)果組織培養(yǎng)再生體系，為將進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)載體用于蘋(píng)果遺傳轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證液泡膜ZomNHX2基因的功能奠定基礎(chǔ)。具體結(jié)果如下：1.根據(jù)genban
5、k中的序列信息設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆得到大葉藻ZomNHX2基因，長(zhǎng)度為1626bp，可編碼541個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白分子量為59.5kDa。2.氨基酸序列比對(duì)分析表明，大葉藻ZomNHX2與其他植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高同源性，其中與馬藺具有最高的同源性。同源比較發(fā)現(xiàn)大葉藻ZomNHX2具有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因典型的氨氯吡嗪結(jié)合位點(diǎn)保守區(qū)域（LFFIVLLPPI）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，ZomNHX2的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主。疏水性分析表明，ZomNHX2的N端具有很強(qiáng)的疏水性，C末端具有較強(qiáng)的親水性，整個(gè)蛋
6、白表現(xiàn)為疏水性?？缒そY(jié)構(gòu)分析推測(cè)，ZomNHX2蛋白具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示大葉藻與馬藺的親緣關(guān)系較近。3.利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)大葉藻ZomNHX2基因在莖和葉中的表達(dá)特異性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在葉中表達(dá)量高于其在莖中表達(dá)量。4.建立蘋(píng)果再生體系。外植體根、莖、葉和子葉在激素誘導(dǎo)下只能形成愈傷組織，而胚芽經(jīng)MS+KT（1mg/L）+NAA（0.2mg/L）培養(yǎng)基的誘導(dǎo)可高效再生叢生芽。為獲得完整幼苗進(jìn)行生根試驗(yàn)，篩選出最適生根的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA（0.2mg/L）。5.蘋(píng)果幼苗耐鹽性研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果幼苗的鹽害率隨著N
7、aCl濃度的升高而升高，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。建議選用4g/L-8g/L的NaCl處理轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果幼苗進(jìn)行耐鹽性分析。-I-哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文關(guān)鍵詞：大葉藻；ZomNHX2基因；克??；表達(dá)；蘋(píng)果組培；耐鹽性-II-哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractZosteramarinabelongstoZosteraL.,isamarinehigherangiosperm.Zosteramarinalivesintheseawaterwhichcontentssaltashighas600tendency,sothesalt-
8、resistanceofZosteramarinaisconsideredtobewell.Thatconfirmsthatitisaperfectmaterialforther
