資源描述：
《杜氏鹽藻RbcS基因家族新成員的克隆與功能分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、中文摘要RbcS(thesmallsubunitsofn'bulose1,5-bisphosphatecarboxylase／oxygenase)基因是編碼l，5．二磷酸核酮糖羧化／加氧酶限ubisco)小亞基的基因。這種酶是葉綠體內(nèi)含量最高的一種蛋白，位于葉綠體基質(zhì)內(nèi)，能催化光合作用中固定C02的反應，其小亞基RbeS對全酶Rubiseo的結(jié)構(gòu)和功能起調(diào)控作用，且常以基因家族的形式定位于一條或多條染色體上，大多數(shù)高等植物中包含4-10個RbcS基因【l】，各基因表達的氨基酸序列有差異，但是蛋白質(zhì)在功能上基本是相似的。高等植物
2、中的RbcS基因家族各成員在植物的各個器官及發(fā)育的各個時期的表達情況不完全一樣【2—3】，所受的調(diào)控機制也不同，這種表達調(diào)控上的不同在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平都存在，各個基因在DNA．蛋白質(zhì)結(jié)合和mRNA穩(wěn)定性方面都存在差異，也就是說以基因家族的形式存在不是單純地為了增加基因產(chǎn)物的表達【41。鹽分是影響植物發(fā)育增殖的一個重要因素，高鹽下，在多數(shù)植物以及藍藻中，鹽脅迫是抑制光合作用的，但鹽藻卻能增強光合作用，Liska等【刪的研究表明當鹽藻從低鹽環(huán)境轉(zhuǎn)移到高鹽環(huán)境時，它能通過增強光合作用，增加C02的同化，從而產(chǎn)生大量甘油，達到適應
3、高鹽環(huán)境的目的。其中RbcS在C02的同化及淀粉合成方面發(fā)揮重要作用，但是鹽藻的RbcS在鹽分脅迫下的表達調(diào)控機制研究不多。本研究根據(jù)RbcS高度保守的氨基酸序列設計簡并引物，采用RACE法擴增其5’和3’上下游未知序列，得到RbcS2新序列。再根據(jù)全長eDNA設計特異引物，利用熒光定量PCR方法分析光照和鹽分對其表達的影響，這些為下一步研究RbcS基因家族中各成員的結(jié)構(gòu)和功能，以及為探索鹽脅迫下鹽藻耐鹽的分子機制提供實驗依據(jù)。實驗方法1簡并引物擴增杜氏鹽藻RbcS基因家族新成員的部分eDNA序列根據(jù)GenBank上登錄的杜氏
4、鹽藻、萊茵衣藻、紅球藻、團藻等藻類的Rbcs基因高度保守的氨基酸序列設計簡并引物。采用TRIzol試劑提取杜氏鹽藻細胞總RNA，用M．MuLV反轉(zhuǎn)錄酶合成eDNA第一鏈為模板，PCR擴增RbcS基因的部分cDNA片段，產(chǎn)物用T．A法亞克隆到pMDl8-T載體上，酶切鑒定后測序，結(jié)果與GenBank上其他物種的RbcS基因比對分析。2RACE擴增杜氏鹽藻RbcS2上下游序列根據(jù)上述擴增出的RbcS2部分cDNA序列設計特異引物，以5’和3’RACE法擴增上下游未知序列，PCR產(chǎn)物用T-A法亞克隆到pMDl8-T載體上，酶切鑒定后
5、測序T中文摘要3杜氏鹽藻RbcS2全長cDNA的拼接和分析將擴增出的簡并cDNA,5’和3’RACEcDNA進行拼接，到eDNA全長序列，并利用DNAMEN和GcnBankBLAST分析核苷酸和氨基酸的同源性及密碼子偏好性。4杜氏鹽藻RbcS2功能分析根據(jù)已克隆到的杜氏鹽藻RbcS2的cDNA設計特異引物，以已知的杜氏鹽藻保守基因GAPDH為內(nèi)參照，Trizol試劑分別提取光照下和不同鹽度下，不同時間培養(yǎng)的鹽藻總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用熒光定量PCR分析其光照和耐鹽功能。實驗結(jié)果l簡并引物擴增杜氏鹽藻RbcS基因家族新成
6、員的部分cDNA序列測序結(jié)果表明，簡并引物擴增得到的部分cDNA片段長為209bp，其氨基酸序列為69個氨基酸。BLAST結(jié)果表明，與GenBank中其他物種的RbcS有很高的同源性，且與杜氏鹽藻RbcSl氨基酸的同源性為84％，說明所得的序列是杜氏鹽藻RbcS的一個新片段?！?RACE擴增杜氏鹽藻RbcS2上下游序列5’RACE得到一個有302個核苷酸的序列，除去部分已知序列及非編碼區(qū)序列，共得到一個有168未知核苷酸的序列，由其推導的氨基酸序列有56個氨基酸殘基，5'UTR部分有90個核苷酸。3'RACE得到一個有489個
7、核苷酸的序列，除去部分已知序列及非編碼區(qū)序列，共得到一個有271未知核苷酸的序列，由其推導的氨基酸序列有90個氨基酸殘基，3'UTR部分有218個核苷酸。3杜氏鹽藻RbcS2全長cDNA的拼接和分析將簡并引物、5’RACE、3’RACE擴增得到的三段cDNA序列拼接起來，得到的cDNA全長為869bp，包含561bp的開放讀碼框，推導成多肽鏈包含187個氨基酸，BLAST結(jié)果顯示，RbcS2的氨基酸序列與其他物種的Rbcs的氨基酸序列有很高的同源性，且與杜氏鹽藻的RbcSl['rl(GcnBank登錄號AY739272)進行同
8、源性分析，核苷酸和氨基酸序列的相似性分別為77．89％和77．19％，說明所得的序列是杜氏鹽藻RbcS的一個新的片段，克隆得到了完整的杜氏鹽藻RbcS基因家族的一個新成員RbcS2基因的cDNA序列，且與其它微藻的氨基酸序列同源性高些，與高等植物的氨基酸序列同源性低。對該基因
