杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和gapdh基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與功能鑒定

《杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和gapdh基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與功能鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、鄭州大學(xué)2008年博士論文杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和GAPDH基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與功能鑒定杜氏幽剿驗I毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和GAPDH基因瓦鼠眍的克隆與功能鑒定博士研究生賈巖龍導(dǎo)師薛樂勛研究員鄭州大學(xué)第一臨床學(xué)院，鄭州450052中文摘要鞭毛／纖毛是細(xì)胞表面的特化細(xì)胞器，在不同的物種中具有高度保守性。實質(zhì)上鞭毛和纖毛結(jié)構(gòu)基本相同，因此在真核生物中?；ハ嘀复?。鞭毛／纖毛不僅存在于單細(xì)胞生物，也存在于高等動物細(xì)胞中。如，纖毛幾乎存在于人類所有細(xì)胞，包括胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞、腦神經(jīng)元以及腎臟上皮細(xì)胞等。除了具有典型的運動功能之外，纖毛／鞭

2、毛在感官和生長發(fā)育過程中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究表明，在多種組織細(xì)胞中纖毛結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)基因的缺陷或突變可能導(dǎo)致多種人類疾病的發(fā)生。如，多囊腎(Polycystickidneydisease，PgD)和一些生長發(fā)育性疾病。最近的一些研究提示纖毛可能在腫瘤發(fā)生中起重要作用：在腫瘤發(fā)生中起重要作用的信號途徑如Hedgehog(Hh)、Smoothened和Wnt似乎都依靠纖毛來傳遞信息的。迄今為止，對于鞭毛／纖毛的研究主要是在線蟲(Caenorhabditiselegans)、果蠅(Drosophila)、四膜蟲(Tetrahymen

3、a)、斑馬魚(zebrafish)、小鼠以及單細(xì)胞模式生物一衣藻(Chamydomonas)中進行的。因為其鞭毛／纖毛在結(jié)構(gòu)和功能上與人類的纖毛極其相似。因此，這些細(xì)胞器鄭州大學(xué)2008年博士論文杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和GAPDH基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與功能鑒定是人類纖毛相關(guān)缺陷或突變性疾病十分理想的研究模式。通過對模式生物進行研究不僅可以幫助我們了解鞭毛／纖毛結(jié)構(gòu)功能與人類相關(guān)疾病的關(guān)系，而且可以闡明許多至關(guān)重要的生命過程，包括細(xì)胞分裂周期、細(xì)胞凋亡和發(fā)育及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。因此，為了解纖毛在發(fā)育和生理過程中的作用，很有必要對纖毛裝配

4、和功能所必需的基因及其蛋白產(chǎn)物進行研究和鑒定。杜氏鹽藻(Dunaliellasalina，Dsalina)是一種比較獨特的高度耐鹽單細(xì)胞真核綠藻：具雙鞭毛而能游動，沒有細(xì)胞壁，含有一個較大的杯狀葉綠體能進行光合作用；可在含有0．05M一5MNaCl的環(huán)境中生長。極其耐鹽的抗逆性能力，簡單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及便利的培養(yǎng)條件使杜氏鹽藻成為重要模式生物和遺傳學(xué)研究的良好材料。鹽藻細(xì)胞可利用其鞭毛進行運動和交配期細(xì)胞間的識別。由于鹽藻鞭毛位于細(xì)胞的表面，所以易于分離并進行生化和遺傳分析。所以，以鹽藻作為模式生物來研究真核細(xì)胞鞭毛的裝配和功能有如下

5、獨特的優(yōu)點：(1)其單倍體基因組適于進行表型遺傳分析；(2)應(yīng)用電轉(zhuǎn)法、粒子轟擊法(基因槍法)和玻璃珠法等轉(zhuǎn)化方法，其核及葉綠體基因組可進行遺傳轉(zhuǎn)化和表達分析；(3)突變體和分子標(biāo)記可用于相關(guān)基因的克隆鑒定。(4)在鹽藻中可以大量提取并純化鞭毛蛋白以進行有效的蛋白水平分析和鑒定。因此，鹽藻的eDNA克隆文庫、遺傳學(xué)分析方法的應(yīng)用以及可進行蛋白提取和純化等均有利于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在鹽藻中的應(yīng)用。除了作為抗逆性和鞭毛研究的模式生物外，杜氏鹽藻作為一種新Ⅱ鄭州大學(xué)2008年博士論文杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和GAPDH基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與

6、功能鑒定型生物反應(yīng)器的研究正越來越受到人們的關(guān)注。杜氏鹽藻用作生物反應(yīng)器，具有培養(yǎng)簡單、營養(yǎng)成分含量高、表達產(chǎn)物下游純化過程簡單等優(yōu)越性。作為一種新型生物反應(yīng)器，較之常規(guī)的微生物發(fā)酵、轉(zhuǎn)基因動植物物等生產(chǎn)體系，具有成本低、高效低廉等優(yōu)點。鹽藻本身屬于真核生物，做為宿主能夠產(chǎn)生近天然活性的重組蛋白，彌補了原核表達系統(tǒng)的缺陷。生產(chǎn)一些外源生物活性物質(zhì)如內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制劑(血管抑素angiostatin，內(nèi)皮抑素endostatin等)、乙型肝炎病毒的疫苗、禽流感疫苗，特別是口服疫苗等，更具有獨特的優(yōu)越性。因此，通過對杜氏鹽藻生物反

7、應(yīng)器系統(tǒng)的研究可以為生產(chǎn)高效、價廉的藥用蛋白，繼而為臨床藥理病理研究及應(yīng)用提供理論和實踐基礎(chǔ)。甘油醛3一磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，它催化3一磷酸甘油醛轉(zhuǎn)變成1，3一二磷酸甘油酸。由于參與了細(xì)胞的基本代謝過程，被認(rèn)為是看家基因，可以作為研究基因表達量的內(nèi)在對照。杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，GAPDH可能是杜氏鹽藻鞭毛組分并在鞭毛的組裝和運動中起非常重要的作用。而且，GAPDH基因的5’端調(diào)控序列可作為高表達的啟動子用于表達外源

8、基因。目前，國內(nèi)外尚未見以鹽藻作為模式生物研究鞭毛結(jié)構(gòu)和功能的報道。本研究第一部分以杜氏鹽藻的鞭毛為研究對象，分離鹽藻鞭毛并提取鞭毛蛋白，采用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)和方法包括生物質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)等在蛋白質(zhì)水平進行鞭毛／纖毛結(jié)構(gòu)和功能的初