杜氏鹽藻mar序列結(jié)合蛋白的原核表達(dá)與功能初步分析

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1、鄭州人學(xué)2007年碩+論文杜氏鹽藻MAR序列結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及功能初步分析杜氏鹽藻MR序列結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及功能初步分析碩士研究生：馮英才導(dǎo)師：薛樂勛鄭州大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭卅I450052中文摘要核基質(zhì)附著區(qū)(matrixattachmentrcgions，MARs)又被稱作核骨架附著區(qū)(scaffoldattachmenlregions，SARs)，是染色質(zhì)被限制性酶消化后仍然結(jié)合在核基質(zhì)上的DNA序列。目前還沒有發(fā)現(xiàn)MARs序列具有保守的一致序列，但是它們之間具有一些共有模體，如：A-box、T-box、酵母自主復(fù)制序列、果蠅拓?fù)洚悩?gòu)酶II識(shí)別位點(diǎn)、彎曲DNA等。近年來的

2、研究發(fā)現(xiàn)，MARs能夠提高外源基因表達(dá)，降低轉(zhuǎn)基因沉默，同時(shí)還能使染色質(zhì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，也可以作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)或者調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，目前關(guān)于MARs的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。真核生物基因的表達(dá)調(diào)控主要是順式作用DNA元件與反式作用蛋白因子的相互作用實(shí)現(xiàn)的，因此要研究某--JIM式作用元件的調(diào)控機(jī)制，必須首先分離與其相互作用的反式作用蛋白因子并研究其功能。能有與MARs序列相結(jié)合的蛋白被稱作MAR結(jié)合蛋白(MAR-bindingproteins，MARBPs)，目前，已經(jīng)有少量MAR相關(guān)的蛋白被克隆出來，但是尚未見到有關(guān)單細(xì)胞藻類杜氏鹽藻MAR結(jié)合蛋白的報(bào)道。杜氏鹽藻(Dunalilla

3、salina)是一種簡單的單細(xì)胞真核綠藻，沒有細(xì)胞壁，是一種抗逆性極強(qiáng)的生物，能在NaCI濃度為0．05～5M的培養(yǎng)液中生存。杜氏鹽藻為單細(xì)胞藻類，沒有組織和器官上的特異分化，因此以它為研究材料來研究MARs調(diào)控機(jī)制有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。前期工作中，我們構(gòu)建了杜氏鹽藻MAR序列文庫，分離出了3個(gè)強(qiáng)MAR序列，克隆出一個(gè)MAR結(jié)合蛋白基因，基因全長1623bp，編碼541個(gè)氨基酸(GenBankaccessionno：墜Q12壘21§!叢墨曼!Q2墨)。為研究MAR結(jié)合蛋白的相關(guān)功能，本研究根據(jù)GenBank上登錄的序列設(shè)計(jì)特異引物，克隆鄭州人學(xué)2007年碩+論文杜氏鹽藻MAR序列結(jié)合蛋白的原

4、核表達(dá)及功能初步分析杜氏鹽藻MARBP基因全長，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌工程菌BL2I(DE3)中表達(dá)MARs序列結(jié)合蛋白，最后利用凝膠滯留試驗(yàn)體外驗(yàn)證它和MARs序列的結(jié)合能力。這將為進(jìn)一步探討其在體內(nèi)的生物功能提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為研究MARs調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。一、杜氏鹽藻AIhRBP基因的克隆及序列分析1方法1．1杜氏鹽藻總RNA的提取采用TIuzol試劑從生長至對(duì)數(shù)期的杜氏鹽藻細(xì)胞中提取鹽藻總RNA。1．2杜氏鹽藻MARBP基因全長的克隆及序列分析根據(jù)GenBank上登錄的MARBP的eDNA全長設(shè)計(jì)引物。以杜氏鹽藻總RNA為模板，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈

5、，并以合成的eDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻MARBP基因的序列全長。PCR產(chǎn)物連接T載體上，測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD．MBP。測(cè)序結(jié)果與GenBank上的MARBP基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并BLAST進(jìn)行同源性分析。2結(jié)果2．1杜氏鹽藻總RNA的制備提取的總RNAOD260／OD280在1．8～2．0之間，OD260／OD230大于2．0，說明純度較高；1％瓊脂糖電泳可見28S和18S兩條清晰的rRNA條帶，且18s與28SrRNA熒光強(qiáng)度比值約為1：2，表明RNA保持較好的分子完整性。2．2杜氏鹽藻MARBP基因全長的克隆及序列分析測(cè)序分析表明，所克隆序列長162

6、3bp，編碼541個(gè)氨基酸；BLAST結(jié)果顯示，該序列與GenBank上登錄的杜氏鹽藻MARBP的eDNA序列具有99％的同源性，而所編碼氨基酸序列之間存在一個(gè)氨基酸殘基的差異。表明所克隆的序列確實(shí)是杜氏鹽藻M越國P基因的eDNA序列。二、杜氏鹽藻M從s序列結(jié)合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)1方法1．1杜氏鹽藻原核表達(dá)載體的構(gòu)建EcoRI和NdeI雙酶切質(zhì)粒pMD．MBP，膠回收并純化MARBPeDNA片段，鄭州人學(xué)2007年碩十論文杜氏鹽藻MAR序列結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及功能初步分析同樣對(duì)pET-28a(+)載體進(jìn)行EcoRI和NdeI雙酶切，純化回收線性載體片段后，用T4DNA連接酶

7、連接目的基因片段和線狀載體，構(gòu)建杜氏鹽藻MARs序列結(jié)合蛋白原核表達(dá)載體pET-MBP。載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，小量提取質(zhì)粒，用EcoRI和NdeI雙酶切鑒定，測(cè)序確定讀碼框是否正確。1．2杜氏鹽藻MARs序列結(jié)合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)將經(jīng)鑒定讀碼框正確的重組原核表達(dá)載體pET-MBP轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌株BL21，挑選陽性菌落，接種到5mL卡那霉素濃度為50mg／L的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)12h，按照1：100的比例接種到新的卡那霉