杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和gapdh基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與功能鑒定

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1、鄭州大學(xué)2008年博士論文杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和GAPDH基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與功能鑒定杜氏幽剿驗(yàn)I毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和GAPDH基因瓦鼠眍的克隆與功能鑒定博士研究生賈巖龍導(dǎo)師薛樂勛研究員鄭州大學(xué)第一臨床學(xué)院，鄭州450052中文摘要鞭毛／纖毛是細(xì)胞表面的特化細(xì)胞器，在不同的物種中具有高度保守性。實(shí)質(zhì)上鞭毛和纖毛結(jié)構(gòu)基本相同，因此在真核生物中常互相指代。鞭毛／纖毛不僅存在于單細(xì)胞生物，也存在于高等動(dòng)物細(xì)胞中。如，纖毛幾乎存在于人類所有細(xì)胞，包括胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞、腦神經(jīng)元以及腎臟上皮細(xì)胞等。除了具有典型的運(yùn)動(dòng)功能之外，纖毛／鞭

2、毛在感官和生長發(fā)育過程中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究表明，在多種組織細(xì)胞中纖毛結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)基因的缺陷或突變可能導(dǎo)致多種人類疾病的發(fā)生。如，多囊腎(Polycystickidneydisease，PgD)和一些生長發(fā)育性疾病。最近的一些研究提示纖毛可能在腫瘤發(fā)生中起重要作用：在腫瘤發(fā)生中起重要作用的信號(hào)途徑如Hedgehog(Hh)、Smoothened和Wnt似乎都依靠纖毛來傳遞信息的。迄今為止，對(duì)于鞭毛／纖毛的研究主要是在線蟲(Caenorhabditiselegans)、果蠅(Drosophila)、四膜蟲(Tetrahymen

3、a)、斑馬魚(zebrafish)、小鼠以及單細(xì)胞模式生物一衣藻(Chamydomonas)中進(jìn)行的。因?yàn)槠浔廾w毛在結(jié)構(gòu)和功能上與人類的纖毛極其相似。因此，這些細(xì)胞器鄭州大學(xué)2008年博士論文杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和GAPDH基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與功能鑒定是人類纖毛相關(guān)缺陷或突變性疾病十分理想的研究模式。通過對(duì)模式生物進(jìn)行研究不僅可以幫助我們了解鞭毛／纖毛結(jié)構(gòu)功能與人類相關(guān)疾病的關(guān)系，而且可以闡明許多至關(guān)重要的生命過程，包括細(xì)胞分裂周期、細(xì)胞凋亡和發(fā)育及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。因此，為了解纖毛在發(fā)育和生理過程中的作用，很有必要對(duì)纖毛裝配

4、和功能所必需的基因及其蛋白產(chǎn)物進(jìn)行研究和鑒定。杜氏鹽藻(Dunaliellasalina，Dsalina)是一種比較獨(dú)特的高度耐鹽單細(xì)胞真核綠藻：具雙鞭毛而能游動(dòng)，沒有細(xì)胞壁，含有一個(gè)較大的杯狀葉綠體能進(jìn)行光合作用；可在含有0．05M一5MNaCl的環(huán)境中生長。極其耐鹽的抗逆性能力，簡(jiǎn)單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及便利的培養(yǎng)條件使杜氏鹽藻成為重要模式生物和遺傳學(xué)研究的良好材料。鹽藻細(xì)胞可利用其鞭毛進(jìn)行運(yùn)動(dòng)和交配期細(xì)胞間的識(shí)別。由于鹽藻鞭毛位于細(xì)胞的表面，所以易于分離并進(jìn)行生化和遺傳分析。所以，以鹽藻作為模式生物來研究真核細(xì)胞鞭毛的裝配和功能有如下

5、獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：(1)其單倍體基因組適于進(jìn)行表型遺傳分析；(2)應(yīng)用電轉(zhuǎn)法、粒子轟擊法(基因槍法)和玻璃珠法等轉(zhuǎn)化方法，其核及葉綠體基因組可進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)分析；(3)突變體和分子標(biāo)記可用于相關(guān)基因的克隆鑒定。(4)在鹽藻中可以大量提取并純化鞭毛蛋白以進(jìn)行有效的蛋白水平分析和鑒定。因此，鹽藻的eDNA克隆文庫、遺傳學(xué)分析方法的應(yīng)用以及可進(jìn)行蛋白提取和純化等均有利于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在鹽藻中的應(yīng)用。除了作為抗逆性和鞭毛研究的模式生物外，杜氏鹽藻作為一種新Ⅱ鄭州大學(xué)2008年博士論文杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析和GAPDH基因及其調(diào)控區(qū)的克隆與

6、功能鑒定型生物反應(yīng)器的研究正越來越受到人們的關(guān)注。杜氏鹽藻用作生物反應(yīng)器，具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、營養(yǎng)成分含量高、表達(dá)產(chǎn)物下游純化過程簡(jiǎn)單等優(yōu)越性。作為一種新型生物反應(yīng)器，較之常規(guī)的微生物發(fā)酵、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物物等生產(chǎn)體系，具有成本低、高效低廉等優(yōu)點(diǎn)。鹽藻本身屬于真核生物，做為宿主能夠產(chǎn)生近天然活性的重組蛋白，彌補(bǔ)了原核表達(dá)系統(tǒng)的缺陷。生產(chǎn)一些外源生物活性物質(zhì)如內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制劑(血管抑素angiostatin，內(nèi)皮抑素endostatin等)、乙型肝炎病毒的疫苗、禽流感疫苗，特別是口服疫苗等，更具有獨(dú)特的優(yōu)越性。因此，通過對(duì)杜氏鹽藻生物反

7、應(yīng)器系統(tǒng)的研究可以為生產(chǎn)高效、價(jià)廉的藥用蛋白，繼而為臨床藥理病理研究及應(yīng)用提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。甘油醛3一磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，它催化3一磷酸甘油醛轉(zhuǎn)變成1，3一二磷酸甘油酸。由于參與了細(xì)胞的基本代謝過程，被認(rèn)為是看家基因，可以作為研究基因表達(dá)量的內(nèi)在對(duì)照。杜氏鹽藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，GAPDH可能是杜氏鹽藻鞭毛組分并在鞭毛的組裝和運(yùn)動(dòng)中起非常重要的作用。而且，GAPDH基因的5’端調(diào)控序列可作為高表達(dá)的啟動(dòng)子用于表達(dá)外源

8、基因。目前，國內(nèi)外尚未見以鹽藻作為模式生物研究鞭毛結(jié)構(gòu)和功能的報(bào)道。本研究第一部分以杜氏鹽藻的鞭毛為研究對(duì)象，分離鹽藻鞭毛并提取鞭毛蛋白，采用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)和方法包括生物質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)等在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行鞭毛／纖毛結(jié)構(gòu)和功能的初