eif4e對食管癌化療藥物敏感性的作用機制研究

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1、中圖分類號UDCR735．1610碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼!Q蔓三三密級公玨elF4E對食管癌化療藥物敏感性的作用機制研究StudyonthemechanismofeIF4Einchemosensitivi鑼一■'0leS0pnagealCanCer作者姓名：學(xué)科專業(yè)：研究方向：學(xué)院(系、所)：指導(dǎo)教師：論文答辯日期絲睦車強蜘趙輝臨床醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)(消化)湘雅醫(yī)院冷愛民教授答辯委員會主席避中南大學(xué)二。一三年五月原創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含

2、其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南大學(xué)或其他單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻均己在論文中作了明確的說明。作者簽名：<箏型駑三+一學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并根據(jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存學(xué)位論文。同時授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。作者簽名：導(dǎo)師簽名

3、：絲』墨年吐月幺日eIF4E對食管癌化療藥物敏感性的作用機制研究摘要背景與目的：食管癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。大量研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞翻譯起始因子4E(eul(叫oticn饑slationinitiationfactor4E，eIF4E)在惡性腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移行為中的發(fā)揮重要作用。eIF4E能特異性地結(jié)合111】塒A5’端m7GpppN帽子結(jié)構(gòu)，是真核細胞胞質(zhì)中mRNA翻譯有效的限速調(diào)節(jié)因子，一旦被激活，該基因通過提高許多癌基因相關(guān)的生長因子的翻譯表達而促進致癌作用。近年來的研究證實，eIF4E在包括食管癌在內(nèi)的多種

4、人類惡性腫瘤及其癌旁組織中過表達，eIF4E逐漸成為評估和判定食管癌惡性程度的重要基因，調(diào)節(jié)eIF4E的水平和活性，抑制腫瘤細胞生長，是腫瘤生物治療學(xué)領(lǐng)域的新思路，但目前有關(guān)eIF4E與食管癌化療藥物敏感性的作用機制研究報道較少。本研究擬以脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞，通過鼬氣Ni技術(shù)調(diào)控食管癌EC9706細胞中eⅢ4E的表達，篩選出穩(wěn)定表達的食管癌細胞，MTT法研究調(diào)控真核細胞翻譯起始因子4E的表達探討與食管癌相關(guān)藥物敏感性的關(guān)系，為進一步探索篩選食管癌的靶向治療提供依據(jù)。方法：1、篩選砌妊干擾有效靶點：將eIF4E的過表達質(zhì)粒PEG

5、FP-N1和eIF4E不同干擾靶點的RN礎(chǔ)病毒載體質(zhì)粒U6．sbRNA．Ⅱ亟±堂僮途塞生塞擅堊CMV-GF’P一1、U6-shRNA-CMV-GFP一2、U6-shRNA—CMV-GFP-3，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染工具細胞293T細胞，24h后熒光顯微鏡下觀測綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況，36h后收集細胞抽提蛋白，采用westemBlot檢測eIF4E的表達情況，實驗結(jié)果通過LeicaApplicationSuite4．o軟件進行灰度值分析，通過計算eIF4E與Q心DH的灰度值比值得到各組細胞eIF4E蛋白的相對表達量。判斷不同靶點的干擾效果，選擇

6、干擾效果最強的對峪i病毒載體質(zhì)粒用于實驗。2、建立eIF4E不同表達水平的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株：將PEGFP．N1質(zhì)粒、U6．shRNA．CMV—GFP質(zhì)粒(篩選出的干擾效果最強的質(zhì)粒)及陰性對照PEGFP-Nl-NC質(zhì)粒、U6．s11I斟A．CMV—GFP-NC質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染到食管癌EC9706細胞中，并用G418抗生素進行抗性篩選、擴大培養(yǎng)，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株eⅢ4E．sm斟A細胞(eIF4E沉默)、eIF4E．OE細胞(eIF4E過表達)、eIF4E—OE-NC細胞(eIF4E過表達空載)、eIF4E．sm斟A-NC細胞(eIF4E沉默

7、空載)。3、通過RealTimePCR和WestemB10t分別從加RNA水平和蛋白質(zhì)水平對各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株進行鑒定：RealTimePCR檢測各組細胞eIF4E砌剛A表達水平，用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析Ct(Cyclethresh01d)值，最后得出的數(shù)據(jù)用2‘△△C‘法計算各組mRNA的相對表達水平。WestemB10t檢測各組細胞蛋白質(zhì)的表達水平，實驗結(jié)果通過LeicaApplicationSuite4．0軟件進行灰度值分析，通過計算eIF4E與@廿DH的灰度值比值得到各組細胞eIF4E蛋白的相對表達量。IⅡ4、MTT法測定各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的化

8、療藥物敏感性：4種不同濃度的化療藥物順鉑(DDP)、氟尿嘧啶口U)、紫杉醇(WⅨ)，分別作用24h、48h后，用MTT法檢測藥物對e口4