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《布魯氏菌s2308asly缺失株構(gòu)建及其生物學(xué)特征研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、摘要布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人、畜共患傳染病，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行并嚴(yán)重危害著人、畜健康。體內(nèi)誘導(dǎo)基因與病原菌在宿主體內(nèi)的生存和致病過程相關(guān)，開展對(duì)體內(nèi)誘導(dǎo)基因在布魯氏菌致病過程中的作用研究,對(duì)闡明布魯氏菌病的發(fā)生發(fā)展以及致病機(jī)制具有參考意義。精氨基琥珀酸裂解酶（argininosuccinatelyase，Asly）是由本實(shí)驗(yàn)室篩選和鑒定的布魯氏菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原，為進(jìn)一步探討Asly在布魯氏菌體內(nèi)感染過程中的作用，研究通過制備Asly單克隆抗體、構(gòu)建Asly缺失株，開展對(duì)Asly生物學(xué)功
2、能研究，探討Asly在布魯氏菌致病過程中的致病機(jī)制。試驗(yàn)主要包括以下內(nèi)容：先以布魯氏菌S2308的基因組為模板擴(kuò)增Asly基因的全長(zhǎng)序列，將其克隆到原核表達(dá)載體pET-28a上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Asly，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，融合蛋白His-Asly以可溶性方式表達(dá)。大量表達(dá)Asly融合蛋白，并用層析柱純化可溶性的融合蛋白His-Asly。Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明融合蛋白His-Asly有免疫原性。使用純化的His-Asly免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融
3、合，用His-Asly蛋白為包被抗原，使用間接ELISA方法對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，最終獲得了一株穩(wěn)定分泌Asly單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為A5F2。BALB/c小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞制備單抗腹水，采用間接ELISA方法和WB方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，同時(shí)鑒定單抗的特異性和穩(wěn)定性。單抗鑒定結(jié)果表明，A5F2的單抗腹水效價(jià)為5.12×106，WB鑒定結(jié)果表明，該株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗具有很強(qiáng)的特異性。構(gòu)建自殺質(zhì)粒pUC19-U-C-D，將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入S2308感受態(tài)細(xì)胞，利用同源重組使氯霉素抗性片段完全取代Asly基因的ORF。PCR篩選、鑒定
4、雙交換的重組陽(yáng)性菌株。陽(yáng)性菌株以Asly單抗腹水作為一抗進(jìn)行WB檢測(cè)，結(jié)果表明，S2308野毒株的全菌蛋白能被Asly單抗腹水識(shí)別，而Asly基因缺失的菌株不能被識(shí)別。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建了S2308ΔAsly缺失株。用S2308野毒株和構(gòu)建的S2308ΔAsly缺失株感染MΦRAW264.7，提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄，以本研究室建立的實(shí)時(shí)熒光定量(real-time)PCR方法檢測(cè)和分析S2308野毒株和構(gòu)建的S2308ΔAsly感染RAW264.7后，RAW264.7細(xì)胞的TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10共6種
5、細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果表明：缺失株侵入至巨噬細(xì)胞后，在0h時(shí)，僅IL-4的表達(dá)水平與野毒株侵入后的表達(dá)水平差異顯著；2h和4h時(shí)，6種細(xì)胞因子的表達(dá)水平均有顯著的差異；8h時(shí)，IIL-4、IL-6的表達(dá)水平無差異；36h時(shí)，IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表達(dá)水平無差異。為了解Asly基因的缺失對(duì)毒力因子的影響，應(yīng)用本研究建立的方法對(duì)per、pmm、sodC、virB4、virB5、virB8、BvrR、BvrS和OMP259種毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明，缺失株中pmm、BvrR、omp25和BvrS四種基因的轉(zhuǎn)錄
6、水平降低，sodC、per、virB4、virB5和virB8的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。對(duì)野生株和缺失株的生長(zhǎng)特性、黏附、侵入MΦ的能力及在MΦ的增殖能力進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：S2308ΔAsly對(duì)MΦ的黏附和侵入能力無明顯變化。胞內(nèi)存活和增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，S2308ΔAsly可以在MΦ內(nèi)存活并增殖，但是增殖能力顯著減弱，表明Asly影響布魯氏菌在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的增殖。綜上所述，試驗(yàn)成功制備了特異性高的Asly單抗；成功構(gòu)建了S2308ΔAsly缺失株；Asly基因的缺失導(dǎo)致細(xì)胞因子差異表達(dá)，毒力因子BvrR和BvrS呈下調(diào)表達(dá)，從而阻礙了MΦ的
7、免疫應(yīng)答；S2308ΔAsly對(duì)MΦ的黏附和侵入能力無變化，胞內(nèi)增殖能力卻大大降低。為進(jìn)一步研究Asly的功能提供參考。關(guān)鍵詞：布魯氏菌，Asly，單克隆抗體，熒光定量，生物學(xué)特性IIAbstractBrucellosisisaworld-widepopularzoonoticinfectiousdiseasecausedbyBrucella,whichseriouslyharmtohumanandlivestock'shealth.Becauseinvivoinducedgenesinfluencetosurvivalandpathogene
8、sisofpathogeninhost,theresearchofeffectinvivoinductedgeneinthepathogenesiso
