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《牛種布魯氏菌2308株wbka、pmm基因缺失株的構(gòu)建及免疫效果的初步研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號：密級：學(xué)號：2010108052單位代碼：10759石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文牛種布魯氏菌2308株wbkA、pmm基因缺失株的構(gòu)建及免疫效果的初步研究學(xué)位申請人桂丹陳創(chuàng)夫教授指導(dǎo)教師喬軍教授申請學(xué)位門類級別農(nóng)學(xué)碩士學(xué)科、專業(yè)名稱預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向畜禽病原分子生物學(xué)所在學(xué)院動物科技學(xué)院中國·新疆·石河子2013年6月ConstructionandpreliminarystudyofimmuneeffectsofB.abortus2308△wbkAand△pmmstrainsADissertationSubmittedtoShiheziUniv
2、ersityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByGuiDan(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuJune2013課題來源973計劃項目項目名稱：布魯氏菌侵染與胞內(nèi)寄生的分子機(jī)制研究項目編號：2010CB530203國家自然科學(xué)基金項目項目名稱：布魯氏菌侵染與胞內(nèi)寄生的分子機(jī)制研究項目編號：31001046摘要布魯氏菌病（Brucellos
3、is，簡稱布?。┦怯筛锾m氏陰性菌布魯氏菌引起的一類人獸共患的慢性傳染病，目前在我國以及世界上大多數(shù)國家有比較廣泛的流行。該病原菌可感染多種家畜及人，還可感染野生動物，近來還發(fā)現(xiàn)該病菌還可感染海洋動物。人類感染布魯氏菌用抗生素治療需要持續(xù)幾個月但不是完全有效，對人類而言沒有有效的疫苗，有幾個許可的活疫苗可以在牲畜上使用，而這些動物疫苗的效果取決于宿主的種類、免疫劑量、免疫途徑。目前世界各國對布病的防控都主要采用的是疫苗接種，然而又因現(xiàn)用疫苗都普遍存在毒力較強(qiáng)，可引起懷孕母畜的流產(chǎn)，甚至還可感染人等缺陷，同時使用了疫苗后難以區(qū)分自然感染和疫苗免疫，從
4、而限制了疫苗的實(shí)際應(yīng)用。因此，本研究擬通過缺失牛種布魯氏菌2308的wbkA，pmm基因構(gòu)建相應(yīng)的缺失株，初步評價其毒力和免疫保護(hù)效果。同時表達(dá)了WBKA，PMM兩個蛋白，開發(fā)出一種能有效區(qū)分自然感染和疫苗免疫的布魯氏菌弱毒基因缺失株，旨在篩選具有潛在應(yīng)用價值的疫苗候選株。本文所做的主要工作及成果如下：1.布魯氏菌2308株wbkA和pmm基因缺失株的構(gòu)建及鑒定：以牛種布魯氏菌2308為模板高保真擴(kuò)增wbkA和pmm基因上下游同源臂，以枯草芽孢桿菌為模板高保真擴(kuò)增SacB基因，將得到的上下臂SacB與分別連接到pGEM-7zf+，構(gòu)建pGEM-7
5、zf-?wbkA-SacB（pwS）和pGEM-7zf-?pmm-SacB（ppS）。自殺載體pGEM-7Zf+上，分別構(gòu)建成pGEM-7Zf+-ΔwbkA和pGEM-7zf+-Δpmm，制備牛種布魯氏菌2308感受態(tài)，電轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pwS和ppS，通過氨芐、蔗糖的兩次篩選得獲得ΔwbkA和Δpmm基因缺失株，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測。2.ΔwbkA和Δpmm基因缺失株的毒力及免疫效果的初步評價：在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7水平初步驗(yàn)證ΔwbkA和Δpmm的毒力；用缺失株免疫6周齡昆明白小鼠，通過CFU計數(shù)初步評價缺失株的毒力；通過常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)初步
6、驗(yàn)證小鼠體內(nèi)的抗體水平，采用間接ELISA方法檢測小鼠體內(nèi)總IgG水平以及細(xì)胞因子IFN-γ的水平；對用缺失株免疫30d后的小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)評價其保護(hù)效果。3.構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-wbkA和pET-pmm及鑒別診斷：用PCR方法分別擴(kuò)增wbkA和pmm基因，將測序正確的基因序列分別克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-32a上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3（BL21）中誘導(dǎo)表達(dá)并純化WBKA和PMM蛋白，再以純化的WBKA和PMM蛋白作為抗原，與缺失株ΔwbkA和Δpmm免疫的小鼠血清進(jìn)行Westernblot分析，鑒定血清中是否存在抗WBKA和PMM的
7、抗體。本研究結(jié)果表明ΔwbkA和Δpmm缺失株具有一定的遺傳穩(wěn)定性，ΔwbkA和Δpmm缺失株的毒力較親本株2308相比有一定程度的下降，且毒力與疫苗株S19差異不大。免疫原性試驗(yàn)結(jié)果顯示同時ΔwbkA和Δpmm缺失株均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的抗體。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明缺失株能保護(hù)小鼠免受2308強(qiáng)毒株的感染，保護(hù)力與疫苗株S19相比略低。WB結(jié)果顯示ΔwbkA缺失株和Δpmm缺失株免疫的小鼠的血清中不能產(chǎn)生抗WBKA蛋白和PMM蛋白的抗體。關(guān)鍵詞：布魯氏菌；wbkA基因；pmm基因；同源重組；免疫保護(hù)性；鑒別診斷AbstractBrucellosisi
8、sazoonoticdiseasecausedbyBrucellawhichisgram-negativeandintracellula
