布魯氏菌omp25基因缺失株的構(gòu)建及對(duì)細(xì)胞自噬的影響

布魯氏菌omp25基因缺失株的構(gòu)建及對(duì)細(xì)胞自噬的影響

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1、分類號(hào):密級(jí):請(qǐng)注明密級(jí)及保密期限學(xué)號(hào):2010108020單位代碼:10759石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文布魯氏菌omp25基因缺失株的構(gòu)建及對(duì)細(xì)胞自噬的影響學(xué)位申請(qǐng)人陳瑞花陳創(chuàng)夫教授指導(dǎo)教師張輝副教授申請(qǐng)學(xué)位門類級(jí)別農(nóng)學(xué)碩士學(xué)科、專業(yè)名稱基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究方向動(dòng)物疾病病理學(xué)所在學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院中國(guó)·新疆·石河子2013年5月ConstructionofBrucella△omp25strainandit’svirulenceevaluationADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPa

2、rtialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByChenRuihua(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuang-fuAssociateProf.ZhanghuiMay,2013課題來源973計(jì)劃項(xiàng)目項(xiàng)目名稱:布魯氏菌侵染與胞內(nèi)寄生的分子機(jī)制研究項(xiàng)目編號(hào):2010CB530203國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目項(xiàng)目名稱:布魯氏菌侵染胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞過程中關(guān)鍵分子

3、的功能研究項(xiàng)目編號(hào):31001046國(guó)家自然基金項(xiàng)目名稱:與nrdp1和socs-1互作的布魯氏菌蛋白的篩選及其作用的分子機(jī)制研究項(xiàng)目編號(hào):31260596中文摘要布魯氏菌病是一種人畜共患的慢性傳染病,動(dòng)物感染該病后的表現(xiàn)為母畜的流產(chǎn)和公畜的睪丸炎,對(duì)人而言,感染該病后可引起人的波浪熱,關(guān)節(jié)炎以及肌肉疼痛等。布魯氏菌(Brucella)作為布魯氏菌病的病原菌,其在宿主內(nèi)的生存機(jī)制一直都是研究的熱點(diǎn)。布魯氏菌本身不產(chǎn)生內(nèi)毒素,其逃避宿主的免疫系統(tǒng)的殺傷作用主要是通過各種毒力因子實(shí)現(xiàn)的,外膜蛋白就是布魯氏菌的重要毒力因子之一,因

4、此本文從布魯氏菌的外膜蛋白基因omp25基因入手,通過以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平和個(gè)體水平上探討布魯氏菌在侵襲宿主時(shí),omp25基因缺失株的毒力和對(duì)細(xì)胞自噬的影響。1根據(jù)GenBank中發(fā)表的布魯氏菌外膜蛋白基因omp25的基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,通過PCR方法擴(kuò)增omp25基因的DNA片段,將擴(kuò)增片段克隆至T載體中,構(gòu)建克隆載體pMD-T-omp25,經(jīng)PCR篩選出陽(yáng)性克隆菌并測(cè)序鑒定,分別將pET28a-GFP質(zhì)粒和測(cè)序成功的pMD-T-omp25質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切,并將回收的omp25基因片段、p

5、ET28a-GFP片段進(jìn)行連接,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-GFP-omp25,將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)中,并純化出帶有綠色熒光的OMP25蛋白,進(jìn)行Westernblot分析可知,OMP25蛋白具有良好的反應(yīng)原性。2根據(jù)GenBank中發(fā)表的布魯氏菌omp25基因序列的上下游基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)上下臂引物,通過PCR方法分別擴(kuò)增上下臂基因序列,然后用融合PCR的方法將回收的上下游基因片段融合并擴(kuò)增。以枯草芽孢桿菌的SacB基因設(shè)計(jì)特異性引物并擴(kuò)增SacB基因序列。然后將融合片段與SacB基因序列分

6、別連接到克隆載體pMD19-Tsimple上,上下游融合片段經(jīng)XholI與SacI雙酶切后連接至自殺載體pGEM-7zf+上,得到pGEM-7zf-?omp25自殺載體,再將SacB基因經(jīng)SacI單酶切連接到帶目的基因的自殺載體中,獲得pGEM-7zf-?omp25-SacB自殺質(zhì)粒,將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至布魯氏菌2308感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過在細(xì)菌內(nèi)部同源重組后,分別經(jīng)100mg/L氨芐抗性篩選和8%蔗糖敏感性篩選,獲得omp25基因突變株,突變株在無抗性布魯氏菌培養(yǎng)基上傳15代,成功獲得遺傳穩(wěn)定的2308?omp25株。用2308

7、?omp25侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8),進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)菌CFU計(jì)數(shù),在細(xì)胞水平上對(duì)2308?omp25進(jìn)行毒力評(píng)價(jià);用2308?omp25感染小鼠,進(jìn)行小鼠脾臟CFU計(jì)數(shù),在個(gè)體水平上對(duì)2308?omp25進(jìn)行毒力評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)缺失株的毒力介于強(qiáng)毒株2308與疫苗株RB51之間。3分別用基因缺失株2308?omp25、流產(chǎn)布魯氏菌(B.abortus)強(qiáng)毒株2308,以及疫苗株RB51侵染胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞HPT-8,選用兔抗人LC3一抗、兔抗人Beclin1一抗和羊抗兔IgG熒光二抗,用免疫組織化學(xué)方法制備細(xì)胞免疫熒光切片,通

8、過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞免疫熒光切片,記錄各個(gè)細(xì)胞免疫熒光I切片的平均熒光強(qiáng)度,分析各菌株對(duì)細(xì)胞自噬的作用程度,同時(shí)在各菌株侵染胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞HPT-8后,提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1的表達(dá)

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