布魯氏菌BP26基因標記疫苗株的構(gòu)建及鑒別

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1、ShortCommunication研究簡報微生物學報ActaMicrobiologicaSinica49(3):405-409;4March2009ISSN0001-6209;CN11-1995PQhttp:PPjournals.im.ac.cnPactamicrocn布魯氏菌BP26基因標記疫苗株的構(gòu)建及鑒別PCR方法的建立1#2#2#111121汪舟佳,甄清,喬鳳,王玉飛,杜昕穎,鐘志軍,趙瑾,于雅琴,黃留玉,1313孫巖松,陳澤良1(軍事醫(yī)學科學院疾病預防控制研究所,北京100071)2(吉林大學公共衛(wèi)生學院,教育部重點實驗室,長春130021)摘要【:目的】由于現(xiàn)有的減毒活疫苗仍存

2、在較強的毒力,因抗原與毒株的差異不大而很難區(qū)分疫苗免疫和自然感染等缺點,限制了現(xiàn)有布魯氏菌減毒活疫苗的廣泛應用。本文擬對布魯氏菌的減毒活疫苗株M5進行遺傳改造,克服這些缺點?！痉椒ā勘狙芯坷猛粗亟M的方法,用卡那抗性基因替換了布魯氏菌減毒疫苗株M5的BP26基因,得到了新的標記疫苗株M5ΔBP26。分別用標記疫苗株和野生株侵染巨噬細胞和感染小鼠,比較分析標記株在細胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)的存活能力。根據(jù)種特異性保守基因dnaK和缺失的BP26基因設計引物,建立雙重PCR,用于區(qū)分標記株與野生株。【結(jié)果】成功構(gòu)建了BP26基因標記疫苗株,細胞實驗和動物實驗結(jié)果表明,標記株仍能在胞內(nèi)和小鼠內(nèi)存活,具備作

3、為減毒活疫苗的特性。小鼠實驗結(jié)果顯示,感219111212染后兩周野生株的細菌數(shù)為10,而突變株為10(P<0101),至第3周野生株的細菌數(shù)為10,而突變株未能檢出,表明與原疫苗株相比,標記株的感染力進一步減弱。根據(jù)DNA序列的差異,建立了能夠區(qū)分標記疫苗株與野生株的雙重PCR方法,標記株因只能擴增出一條帶而能與野生株和毒株相區(qū)分,從而可以區(qū)分自然感染和疫苗免疫?！窘Y(jié)論】基因標記疫苗株的構(gòu)建及鑒別PCR方法的建立,為布魯氏菌疫苗的進一步研發(fā)奠定了基礎。關(guān)鍵詞:布魯氏菌;26kDa外膜蛋白;標記疫苗株中圖分類號:R37文獻標識碼:A文章編號:000126209(2009)0320405205

4、布魯氏菌引起的布魯氏菌病是典型的人獸共患斷傳播途徑,開展布魯氏菌病的治療工作,具有十分[1]傳染病,給我國畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失,也重要的意義。針對布魯氏菌病的診斷以及布魯氏嚴重威脅人民的健康生活,是一個重要的公共衛(wèi)生菌的檢測的研究一直在進行,也取得了一些重要進問題。近年來,人間布魯氏菌病的發(fā)病數(shù)一直呈上展,這些方法在布魯氏菌病的診斷和監(jiān)測中發(fā)揮了[2-4]升趨勢,已超過歷史最高水平。人布魯氏菌病主要重要作用。布魯氏菌病是一種慢性傳染性疾來源于動物布魯氏菌病,因此,盡管沒有完整的監(jiān)測病,預防該病的發(fā)生是控制該病的重要措施。布魯體系,但可以預測動物間的布病發(fā)病率也很高。準氏菌病的預防主要

5、是通過接種疫苗來實現(xiàn),現(xiàn)有的確的診斷,對于及時發(fā)現(xiàn)疫情,徹底清除傳染源,切疫苗主要是減毒活疫苗,如M5、S2和A19等。這些疫苗具有較好的免疫保護效果,在預防和控制布魯基金項目:國家自然科學基金(30600024);國家“863計劃”(2007AA02Z412)3通信作者。TelPFax:+86266948434;E2mail:zeliangchen@yahoo.com(陳澤良),sunys1964@hotmail.com(孫巖松)#作者簡介:對本文有同等貢獻。汪舟佳(1981-),女,浙江諸暨人,碩士,現(xiàn)主要從事預防醫(yī)學研究,E2mail:grace2zhuji@1631com;甄清(19

6、65-),女,黑龍江人,副教授,現(xiàn)主要從事病原菌致病機制研究,E2mail:zq415@sina.com;喬鳳(1979-),女,黑龍江佳木斯人,博士研究生,現(xiàn)主要從事預防醫(yī)學研究,E2mail:phoenixqiao@foxmail.com收稿日期:2008208202;修回日期:2008212215406ZhoujiaWangetal.PActaMicrobiologicaSinica(2009)49(3)氏菌病的蔓延和擴散中起到了重要作用。但是,這R引物擴增N端同源臂,用BP262C2F和BP262C2R些疫苗還存在一個很大的缺點,即仍存在一定的毒引物擴增C端同源臂。PCR產(chǎn)物用1%的

7、瓊脂糖凝力,可能導致免疫后發(fā)病,并且,由于疫苗株與野生膠電泳分離,切膠回收PCR產(chǎn)物。N端片段用Sac[5-6]毒株的抗原性相近,很難與自然感染的相區(qū)分。Ⅰ和XhoⅠ酶切后與pUC19K線性質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化針對減毒活疫苗的這些缺點,本研究擬在減毒活疫DH5α,涂卡那抗性平板,抗性克隆用N端同源臂的苗株的基礎上,對菌株進行改造,敲除布魯氏菌的重擴增引物進行鑒定,PCR陽性的克隆提取質(zhì)粒,進行要診斷抗原bp26基因