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《布魯氏菌vjbr基因標(biāo)記疫苗株構(gòu)建、免疫保護(hù)性分析及鑒別診斷的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、西南大學(xué)碩士學(xué)位論文捅要摘要布魯氏菌病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的入畜共患病，它的流行不僅對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重?fù)p失，而且給人類健康帶來很大威脅。減毒活疫苗是目前預(yù)防布魯氏菌病效果最好的疫苗形式，在國(guó)內(nèi)外有廣泛的使用，然而，由于存在毒力殘存、免疫后無法鑒別診斷等缺點(diǎn)，其使用受到限制。為了克服現(xiàn)有疫苗的這些缺點(diǎn)，利用敲除抗原基因的方法構(gòu)建標(biāo)記疫苗株，并評(píng)價(jià)標(biāo)記株作為候選減毒活疫苗的可行性，已成為尋找理想減毒活疫苗的一種重要策略。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)標(biāo)記疫苗株的研究情況，在實(shí)驗(yàn)室前期研究成果的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)16MAvjbR作為標(biāo)記疫苗株的可行性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。首
2、先采取抗性替換的方法，重新構(gòu)建了訂6R抗性基因替換株，然后對(duì)標(biāo)記菌株的毒力表型進(jìn)行了確認(rèn)，對(duì)其保護(hù)性和保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了分析。之后，進(jìn)行了啪R的體外克隆、表達(dá)，并探討其區(qū)分疫苗免疫與自然感染的能力，建立了鑒別診斷方法。由于布魯氏菌不含質(zhì)粒，很多外源質(zhì)粒均不能在細(xì)菌中復(fù)制，基于此特點(diǎn)，我們建立了一種快速構(gòu)建布魯氏菌無痕缺失突變體的方法，并成功構(gòu)建了qbR的突變株：將1，加R基因兩側(cè)同源臂分別與卡那抗性基因進(jìn)行PCR融合，得到含有兩側(cè)同源臂和抗性基因的突變盒序列，然后利用T載體克隆，將突變盒序列克隆到T載體，將得到的重組載體轉(zhuǎn)入布魯氏菌中，通過抗性篩選得到巧6R基因被
3、卡那基因替換的缺失標(biāo)記株16MAvjbR。用16MAvjbR標(biāo)記株腹腔接種免疫小鼠，在免疫后的2、4、6周分別采集免疫小鼠血清，監(jiān)測(cè)抗體產(chǎn)生，分離小鼠的脾臟，用菌體蛋白刺激，分析免疫后小鼠的細(xì)胞免疫，進(jìn)行免疫保護(hù)性研究。實(shí)驗(yàn)中我們采用了疫苗株Rev．i免疫組做為陽性對(duì)照，生理鹽水PBS組作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用缺失標(biāo)記株16MAvjbR免疫的BALB／c小鼠能夠?qū)σ吧昕hmelitensisl6M產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)效果。同時(shí)，突變株誘導(dǎo)了特異性抗體IgG的分泌。其細(xì)胞免疫水平IFN吖以及IL．10均有分泌。這說明缺失標(biāo)記株16MAvjbR能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫
4、和體液免疫，并起到明顯的保護(hù)作用。缺失標(biāo)記株16MAvjbR能否作為候選疫苗還與是否有合適的診斷抗原有關(guān)。我們對(duì)布魯氏菌重組蛋白啊bR進(jìn)行了體外表達(dá)，分別用缺失標(biāo)記株16MAvjbR、野生株丑melitensisl6M免疫BALB／e小鼠，用免疫的小鼠血清與純化的蛋白反應(yīng)來評(píng)價(jià)蛋白作為診斷抗原的可能性。通過Westernblot和間接ELISA法對(duì)蛋白的免疫原性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示vjbR能夠作為診斷抗原，可用于區(qū)分疫苗免疫和自然感染。以上結(jié)果表明，16MAvjbR是一個(gè)良好的候選減毒活疫苗株，值得進(jìn)一步研究。一。關(guān)鍵詞：布魯氏菌，vjbR，標(biāo)記疫苗株，融合P
5、CR，免疫保護(hù)，診斷抗原西南大學(xué)碩士學(xué)位論文ABSTRACT皇量皇量曼鼉,]il．．．I!LIIIJII!I曼ABSTRACT．BrucellosisisaworldwidezoonoticdiseasecausedbyBrucellapathogens，whichlcadtOseriouseconomiclOSSandpublichealthrisk．LiveattenuatedvaccineshavebeenproventObethebestvaccinesandareusedworldwideforpreventionagainstanimalbruce
6、llosis．However．itsuseislimitedduetOitsresidualvirulenceandidentificalimmuneresponsestOthoseinducedbyinfection．Toresovletheseshortcomings，numerouseffortshavebeenmadetOdevelopnewvaccinesbytargeteddeletionofvirulencegenesorantigenicones，beinganimportantstrategyforidealliveattenuatedvac
7、cinedevelopment．AccordingtOthereports011markedvaccinestrainsandresultsfromourpreviousstudy，thefeasibilityof16MAvjbRasavaccinecandidateWasevaluatedinthisstudy．First,amutant16MAvjbRWasreconstrctedusingresistancereplacementmethod．Then,theattenuationphenotypesareconfirmed,andtheprotecti
8、onandimmunogenicity
