自噬在造血系統(tǒng)中的輻照保護作用

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1、萬方數(shù)據(jù)蘇州大學學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學位論文是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學或其它教育機構(gòu)的學位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人承擔本聲明的法律責任。論文作者簽名：坌隧日期：加f畢’Io‘愛萬方數(shù)據(jù)蘇州大學學位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解蘇州大學關(guān)于收集、保存和使用學位論文的規(guī)定，即：學位論文著作權(quán)歸屬蘇州大學。本學位論文電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的

2、內(nèi)容相一致。蘇州大學有權(quán)淘國家圖書館、中國社科院文獻信息情報中心‘中國科學技術(shù)瘩息研究所(含萬方數(shù)據(jù)電子出版社)、中國學術(shù)期刊(光盤版)電子雜志社送交本學位論文的復印件和電子文檔，允許論文被查閱和借嗣，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存和匯編學位論文，可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索。涉密論文凸本學位論文屬在年月解密岳適用本規(guī)定。非涉密論文口論文作者簽名：導師簽名：E1期：蘭!竺!!口·8萬方數(shù)據(jù)自噬在造血系統(tǒng)中的輻照保護作用中文摘要目的：造血干細胞是各類血細胞的來源，電離輻射可能導致造血系統(tǒng)細胞的DNA損傷，而這些損

3、傷如果不能被有效修復，極有可能引起染色體重排，導致基因組不穩(wěn)定、細胞凋亡甚至癌變。迄今，尚無利用自噬機制增強機體抗輻射保護造血干細胞基因組穩(wěn)定的研究。本研究利用條件性基因敲除小鼠模型(自噬機制缺失)和腹腔注射mTOR抑制劑rapamycm的小鼠模型(激活自噬機制)，闡明造血干／祖細胞在核輻射后其DNA損傷修復作用是否依賴于自噬機制以及闡明自噬通過何種方式保護輻照下的造血干／祖細胞。具體目標：A)研究自噬機制是否通過有效清除ROS來保護造血干／祖細胞。B)研究白噬機制與輻照引起的造血干／祖細胞DNA損傷修復途徑的關(guān)聯(lián)和作用機制。方法：從小鼠骨

4、髓中分離出正常骨髓細胞體外培養(yǎng)，經(jīng)rapamycin激活或bafilomycinA1抑制自噬，提取蛋白，WesternBlot檢測LC3、4EBPl。將BM細胞不同藥物處理24h后輻照3Gy，分別于輻照前及輻照后24h、48h和72h進行細胞計數(shù)和凋亡檢測(AnnexinV／PI)，于輻照前、后2h分別用3，-H2A．X流式檢測和免疫熒光觀察骨髓細胞DNA雙鏈損傷情況。為了進一步驗證在體內(nèi)激活自噬能否同樣對造血系統(tǒng)有輻照保護作用，Ctrl組和Rap組分別在小鼠腹腔注射vehicle和rapamycin，共5次。小鼠整體輻照5Gy，分別于輻照

5、前、輻照后短期時間6h、ld、3d、5d、7d及輻照后長期時間40d、70d和100d測外周血象。BM用ficoll液梯度離心得到的全骨髓單個核細胞，接著用磁珠分選出lin+和lift細胞，再用流式細胞儀分選出lin一細胞中標記Scal和c—kit抗體雙陽性的細胞群LSK。輻照24h后分別取BM、lin+、lin一和LSK細胞流式檢測，／-H2A．X的陽性細胞率。比較Ctrl組和Rap組小鼠輻照前，及輻照1Gy和3Gy后骨髓細胞的集落生成能力。流式檢測兩組小鼠輻照前后體內(nèi)LSK、LT-LSK、ST-LSK的占全骨髓單個核細胞數(shù)的比例。進而，

6、取At97∥f-MXl一Cre四周齡的小鼠腹腔注射PIPC，注射完6周后，取小鼠進行基因鑒定。沖骨髓提取RNA和蛋白，檢測At97在骨髓mRNA水平及蛋白萬方數(shù)據(jù)中文摘要自噬在造血系統(tǒng)中的輻照保護作用水平都被敲除。將Ctrl組和At974組小鼠整體輻照5Gy，測量外周血象、24h后取LSK細胞流式檢測7-H2A．X的陽性細胞率。At974組小鼠在輻照前分別腹腔注射vehicle和rapamycin，5Gy輻照后比較兩組的外周血象和輻照8h后流式檢測兩組外周血的丫-H2A．X的陽性細胞率。比較Ctrl、Rap和At97十三組小鼠輻照前，及輻照

7、5Gy后骨髓細胞的集落生成能力。同時流式檢測Ctrl組和At97+組小鼠輻照前后體內(nèi)LSK占全骨髓單個核細胞數(shù)的比例。DCF探針檢測各組骨髓細胞ROS產(chǎn)量的差異，利用QIAGEN公司的RT：Pr06lerTMPCRArrayMouseDNARepair檢測Ctrl組、Rap組和At97斗組5Gy輻照4d后LSK中DNA損傷修復相關(guān)基因的表達。并通過流式細胞儀檢測參與HR和NHEJ途徑的Rad51和DNAliglV的蛋白表達陽性率，WestenBlot檢測HR和NHEJ途徑相關(guān)蛋白的表達變化。H&E染色顯示三組小鼠輻照前后的脾切片。結(jié)果：不同

8、藥物體外處理骨髓細胞，24h后Rap組LC3一I轉(zhuǎn)化LC3．II增高，表明體外給予rapamycin提高了細胞的自噬水平。各藥物處理組細胞輻照前的增殖速度和凋亡與C仃l組比較沒有