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1、全局因子DasR和Crp對莫能菌素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控ThetranscriptionalregulationofglobalfactorsDasRandCrpinmonensinbiosynthesis學(xué)科專業(yè)：制藥工程研究生：張玥指導(dǎo)教師：趙廣榮天津大學(xué)化工學(xué)院二零一七年五月萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝之處外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得天津大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我
2、一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。特授權(quán)天津大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說明）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日2萬方數(shù)據(jù)中文摘要聚醚類抗生素莫能菌素是肉桂地鏈
3、霉菌產(chǎn)生的一種天然產(chǎn)物，在農(nóng)業(yè)中普遍應(yīng)用于治療球蟲病以及作為反芻動(dòng)物的增重劑，最近也被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性。莫能菌素生物合成基因簇大小為97kb，包含17個(gè)功能基因，以及三個(gè)途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因monRI，monRII，monH，但其生物合成過程的全局調(diào)控機(jī)制還未見報(bào)道。本文研究了全局調(diào)控因子DasR和Crp對莫能菌素生物合成的調(diào)控效應(yīng)，詳述了它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，并通過代謝調(diào)控構(gòu)建了高產(chǎn)莫能菌素的肉桂地鏈霉菌工程菌株。通過dasR基因的過表達(dá)，將莫能菌素的產(chǎn)量提高68.6%，dasR基因的sRNA反義抑制和敲除結(jié)果
4、，表明了在富營養(yǎng)的條件下，DasR對莫能菌素的生物合成起正向調(diào)控作用。凝膠遷移電泳和半定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了DasR是通過直接結(jié)合在monAIX，monE，monT和monRII的啟動(dòng)子區(qū)域并提高這些基因的轉(zhuǎn)錄水平來正向調(diào)控莫能菌素的生物合成的。在肉桂地鏈霉菌中，GlcNAc的代謝產(chǎn)物也可以作為DasR蛋白的效應(yīng)分子抑制蛋白功能。由以上結(jié)果，本文提出了以DasR為核心，由微生物體外到體內(nèi)，涉及信號(hào)分子、全局調(diào)控因子、途徑特異性調(diào)控因子和生物合成基因的二級調(diào)控機(jī)制。過表達(dá)crp基因使莫能菌素產(chǎn)量提高51.0%，
5、反義抑制crp基因使莫能菌素產(chǎn)量降低45.1%，正反兩方面結(jié)果表明了Crp對莫能菌素的生物合成起正向調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄組測序分析定位了所有受Crp調(diào)控的初級代謝和次級代謝基因，再借助半定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Crp直接上調(diào)了控制聚酮合成前體供應(yīng)的關(guān)鍵初級代謝基因的轉(zhuǎn)錄，以及基因簇內(nèi)部monAI-monAV，monAVII，monAVIII，monCI，monD，monAX和monRI這11個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，表明了Crp主要是通過調(diào)控莫能基因簇內(nèi)部基因（包括途徑特異性調(diào)控基因和生物合成基因）以及調(diào)控控制抗生素前體供應(yīng)的初級
6、代謝基因這兩方面來推動(dòng)莫能菌素的生物合成的。通過組合過表達(dá)全局調(diào)控基因dasR，crp以及途徑特異性調(diào)控基因monRI，monRII，monH，構(gòu)建了高產(chǎn)莫能菌素的工程菌株，產(chǎn)量比原始菌株提高1.2倍，效價(jià)達(dá)1326mg/L。過表達(dá)多個(gè)正調(diào)控基因是一種有效手段，在改造工程菌株提高抗生素產(chǎn)量領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：肉桂地鏈霉菌；莫能菌素；全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；次級代謝；DasR；CrpI萬方數(shù)據(jù)II萬方數(shù)據(jù)ABSTRACTThepolyetherionophoreantibioticmonensinisprodu
7、cedbyStreptomycescinnamonensisandusedasacoccidiostatforchickensandgrowthpromotingagentforcattle.Recently,itwasfoundtoexhibitantitumoractivity.The97kbmonensin(mon)biosyntheticgeneclusterhasbeenclonedandthefunctionsoftwentyputativegeneswerepartiallycharacterize
8、d,includingthreepathway-specificregulatorygenes,monRI,monRIIandmonH,buttheglobaltranscriptionalregulatorymechanisminmonensinbiosynthesisremainselusive.Inthisstudy,weillustratedtheregulato
