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《豬圓環(huán)病毒2型cc12毒株感染性克隆構(gòu)建及小鼠感染模型初步研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、豬圓環(huán)病毒2型CC12毒株感染性克隆構(gòu)建及小鼠感染模型初步研究RescueoftheinfectiousvirusfromPCV2CC12clonedgenomicDNAandmouseinfectionmodel作者姓名：賈川川專業(yè)名稱：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：王新平教授學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士答辯日期：2015年6月2日中文摘要豬圓環(huán)病毒病（Porcinecircovirusdiseases）是由豬圓環(huán)病毒2型引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的新發(fā)傳染病，以斷奶仔豬生長發(fā)育不良、消瘦、呼吸困難、皮下淋巴結(jié)高度腫大、出血和壞死，
2、母豬繁殖障礙為主要特征。本研究應(yīng)用PCR擴增病毒基因組序列和免疫學(xué)等技術(shù)方法確診長春市某規(guī)?；B(yǎng)豬場暴發(fā)的一起斷奶仔豬病因未明疫病為豬圓環(huán)病毒2型感染，并應(yīng)用病毒分離技術(shù)獲得一株豬圓環(huán)病毒2型毒株，命名為PCV2CC12毒株。序列測定與比對分析發(fā)現(xiàn)CC12毒株的基因組存在獨特的突變。與目前已知PCV2毒株相比，CC12毒株基因組第607位核苷酸由腺嘌呤（A）突變?yōu)轼B嘌呤（G），該突變導(dǎo)致所編碼的Rep蛋白第186位氨基酸由天冬酰胺（N）突變?yōu)榻z氨酸（S）。此外，CC12毒株編碼的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白Cap亦存在兩個少見突變，
3、包括59位氨基酸由精氨酸（R）突變?yōu)橘嚢彼幔↘），190位氨基酸由丙氨酸（A）突變?yōu)樘K氨酸（T）。核苷酸和氨基酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)CC12毒株與目前國內(nèi)豬群流行的毒株相似，屬于PCV2b基因型。該結(jié)果為防控該病提供了流行病學(xué)理論依據(jù)。根據(jù)CC12毒株的完整基因組序列，設(shè)計合成引物，以PCR擴增病毒的全基因組序列，并將其插入pBluescriptIISK載體構(gòu)建獲得CC12株單拷貝基因組重組質(zhì)粒，并以此構(gòu)建了正向雙拷貝重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的感染性克隆以脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后，經(jīng)過連續(xù)盲傳8代后，應(yīng)用PCR方法、間接
4、免疫熒光技術(shù)（IFA）、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗（IPMA）和免疫印跡技術(shù)（Westernblot）檢測到病毒核酸分子和病毒Cap結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)，表明CC12毒株拯救成功。我們將拯救的CC12毒株命名為rCC12。rCC12與親本病毒具有相似的TCID50病毒滴度和生物學(xué)特性。該結(jié)果為研究PCV2復(fù)制機理、致病機制及病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用提供了有效的工具和平臺。I將CC12病毒通過腹腔注射途徑接種昆明小鼠，通過檢測不同時間病毒在體內(nèi)的分布及其引起的病理損傷與誘導(dǎo)的抗體水平，建立病毒感染小鼠模型。免疫組織化學(xué)檢測P
5、CV2病毒抗原的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠感染初期病毒主要分布于肝臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)、心臟、肺臟和胸腺；而感染35天后，PCV2主要集中在淋巴結(jié)，這與PCR檢測結(jié)果基本一致；組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，感染小鼠肺臟、肝臟、胸腺、淋巴結(jié)、脾臟均出現(xiàn)程度不一的炎性病變或壞死；ELISA檢測抗體結(jié)果顯示，小鼠接種PCV2后第7天可以檢測到抗體，第28天抗體水平達(dá)到最高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。關(guān)鍵詞：PCV2，分離鑒定，感染性克隆，病毒拯救，小鼠模型IIAbstractPorcinecircovirusdiseases（PCVD）isaPCV2
6、-associateddiseaseentitiesandoneofthesevereinfectiousdiseasesaffectingpigindustryworldwide.Thisinfectioniscausedbyporcinecircovirustype2,amemberofgenusCircoviruswithinthefamilyofCircoviridae,andcharacterizedbyweightlossorwasting,palloroftheskin,respiratorydistr
7、ess,diarrhea,icterus,reproductivefailureandenlargedsubcutaneouslymphnodes.Inthisstudy,anovelporcinecircovirus2(PCV2)strain,designatedasPCV2CC12,wasdetectedandisolatedfrompigswithclinicalsignsofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)inChangchun.Sequenceali
8、gnmentanalysisrevealedauniquemutationatpositionofnucleotide607(607A>G),leadingtoatransitionofaminoacidfromAsparaginetoSerineatpositionof186(N186S)intheRepprotein.Inaddition,
