神經(jīng)浸出液誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞分化的研究與應(yīng)用

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1、分類號(hào)UDC密級(jí)編號(hào)專業(yè)碩士學(xué)位論文神經(jīng)浸出液誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞分化的研究與應(yīng)用TheresearchandapplicationforSchwann-likecelldifferentiationofadiposederivedstemcellsinducedbyneuralleachate學(xué)位申請(qǐng)人：張春燕指導(dǎo)教師：鄧雯教授合作教師：劉玉梅副教授專業(yè)領(lǐng)域：獸醫(yī)學(xué)位類別：獸醫(yī)碩士2015年05月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，文中除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫

2、過(guò)的研究成果，也不包含為獲得河南科技大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的其他學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：日期：I摘要摘要周圍神經(jīng)損傷在臨床中比較常見(jiàn)，由于成熟的神經(jīng)元不能分裂增殖，因此，外周神經(jīng)損傷后的修復(fù)效果很不理想。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，人們用組織工程神經(jīng)代替自體神經(jīng)修復(fù)外周神經(jīng)損傷并取得了較好效果。組織工程神經(jīng)的構(gòu)建主要包含種子細(xì)胞、支架材料和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子三個(gè)方面，其中理想的種子細(xì)胞是構(gòu)建人工神經(jīng)的前提和基礎(chǔ)。雪旺細(xì)胞（Schwanncells，SCs）在神經(jīng)再生中起重要作用，

3、是修復(fù)神經(jīng)損傷理想的種子細(xì)胞。但是SCs體外培養(yǎng)困難，增殖速度慢，且培養(yǎng)過(guò)程中容易受到成纖維細(xì)胞污染，不能滿足神經(jīng)修復(fù)的要求。脂肪源性干細(xì)胞（Adiposestemcells，ADSCs）是具備多向分化潛能的干細(xì)胞，在特定環(huán)境下可以向SCs分化，同時(shí)，ADSCs還具有來(lái)源廣泛、取材簡(jiǎn)便、并發(fā)癥少、增殖速度快、擴(kuò)增穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此可以成為組織工程神經(jīng)理想的種子細(xì)胞來(lái)源。然而目前常用的誘導(dǎo)ADSCs向SCs分化的方法都存在一定的弊端。本研究應(yīng)用共培養(yǎng)原理，利用外周神經(jīng)分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)誘導(dǎo)ADSCs向SCs分化，以期簡(jiǎn)化操作程序，節(jié)約誘導(dǎo)成本，為解決臨床上修

4、復(fù)外周神經(jīng)損傷過(guò)程中的種子細(xì)胞難題提供新思路，整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為五個(gè)部分。1.大鼠ADSCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定無(wú)菌條件下取出3周齡SD大鼠兩側(cè)腹股溝脂肪，采用Ⅰ型膠原酶消化法獲得單細(xì)胞懸液，并培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中。通過(guò)骨向和脂向分化以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面Marker對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)后ADSCs形成典型的黑色鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈現(xiàn)紅色；成脂誘導(dǎo)后逐漸出現(xiàn)脂滴，油紅O染色為紅色。流式檢測(cè)結(jié)果顯示：CD44和CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，CD31和CD45呈陰性。以上結(jié)果證實(shí)，分離到的細(xì)胞為ADSCs。2.ADSCs體外特性研究本

5、部分的目的是掌握ADSCs的體外分化特性，為選擇合適的傳代次數(shù)和適宜的接種密度提供理論基礎(chǔ)。將ADSCs培養(yǎng)至12代，然后誘導(dǎo)第3、6、9和12代的ADSCs向成骨和成脂分化，并通過(guò)茜素紅和油紅O染色對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)5232行檢測(cè)。同時(shí)選取第3代ADSCs用兩種不同的密度（5×10/cm和1×10/cm）進(jìn)行接種，再用Western-blot檢測(cè)第3、6、9、12代以及兩種不同傳代密度的ADSCs的BMP-2的表達(dá)，并檢測(cè)第1-12代ADSCs的堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）活性。結(jié)果證實(shí)，第3、6、9、12代的ADSCs均可被誘

6、導(dǎo)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，但隨著傳代次數(shù)的增加，ADSCs成脂分化潛能逐漸降32低，成骨能力未見(jiàn)明顯差異。第12代以及以1×10/cm密度培養(yǎng)的ADSCs的1摘要BMP-2呈陽(yáng)性表達(dá)；隨著傳代次數(shù)的增加，第1-12代的ADSCsALP活性逐步3252增加，1×10/cm密度培養(yǎng)的ADSCs的ALP活性較5×10/cm接種的ALP活性顯著增加。ADSCs在體外連續(xù)傳代或者以較低密度接種時(shí)可導(dǎo)致衰老并自發(fā)分52化成骨。因此ADSCs的體外研究應(yīng)選擇3-5代，并以5×10/cm的密度進(jìn)行傳代較為適宜。3.神經(jīng)浸出液的制備及對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)樣分化的影響無(wú)菌采集的大鼠

7、坐骨神經(jīng)通過(guò)剪碎、浸泡、過(guò)濾制備出神經(jīng)浸出液，待用。為了初步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室制備的神經(jīng)浸出液具有促進(jìn)前體細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的潛能，本研究選擇PC12細(xì)胞作為前體細(xì)胞模型，將制備好的神經(jīng)浸出液代替PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基，觀察PC12細(xì)胞軸突分化情況。對(duì)神經(jīng)浸出液培養(yǎng)第3、6、9d的PC12細(xì)胞軸突長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)，并檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物β3-tubulin和MAP-2的表達(dá)。結(jié)果顯示，神經(jīng)浸出液培養(yǎng)的PC12細(xì)胞明顯長(zhǎng)出突起，第3、6、9d的軸突平均長(zhǎng)度分別達(dá)到28.07±1.76μm、58.14±2.60μm、170.43±10.08μm；神經(jīng)元標(biāo)志物β3-tub

8、ulin和MAP-2蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，初步證實(shí)神經(jīng)浸出液具有誘導(dǎo)前體