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1、分類號：密級：學(xué)號：單位代碼：石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文蛋雞子宮內(nèi)膜細胞鈣轉(zhuǎn)運及蛋殼鈣化早期鈣沉積機制的研究學(xué)位申請人葉幼榮指導(dǎo)教師孫杰副教授申請學(xué)位門類級別農(nóng)學(xué)碩士學(xué)科、專業(yè)名稱動物遺傳育種與繁殖研究方向動物遺傳資源利用與分子育種所在學(xué)院動物科技學(xué)院中國·新疆·石河子2015年6月Theresearchofcalciumtransportinginchickenendometrialcellsandthemechanismsofcalciumdepositionininitialstageofeggshel
2、lcalcificationADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByYeYou-rong(AnimalGeneticsandbreeding)DissertationSupervisor:Pre-Prof.SunJieJune2015摘要目的：研究孕酮對蛋殼鈣化初期與鈣沉積相關(guān)的基質(zhì)蛋白和基因表達的影響，初步探討鈣化起始時
3、的鈣沉積機制。方法：本研究以產(chǎn)蛋高峰期蛋雞作為實驗動物，體外培養(yǎng)蛋雞子宮內(nèi)膜細胞，測定細胞生長曲線，檢測不同濃度的激素對細胞體外增殖和鈣離子濃度的影響，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)2+（RTQ-PCR）檢測不同處理組細胞中Cabp-d28k、Ca-ATPase、碳酸酐酶(CA)、TRPV6、骨橋蛋白(OPN)、卵鐵傳遞蛋白(Ovotransferrin)、卵清蛋白(Ovalbumin)、Ovocleidin17和凝集素(Clusterin)等基因的表達量變化。在此基礎(chǔ)上對蛋雞進行孕酮和孕酮受體拮抗劑處理，
4、蛋殼鈣化初期（排卵后4.5-5.5h）采集子宮組織和蛋殼，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察蛋殼超微結(jié)構(gòu)變化，測定子宮中鈣離子濃度及相關(guān)基因表達量的變化規(guī)律，對基因的表達量變化與超微結(jié)構(gòu)的相關(guān)性進行分析，并采用免疫組化和免疫印跡（Western-Blotting）分析Cabp-d28k和Ovalbumin蛋白在子宮中的變化。結(jié)果：本研究成功培養(yǎng)了蛋雞子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞，并測得兩種細胞的生長曲線；添加100nM的孕酮能顯著（P<0.05）促進上皮細胞和基質(zhì)細胞的體外增殖；激素對體外培養(yǎng)的細胞中鈣離子濃度的
5、影響不顯著（P>0.05），但雞體經(jīng)孕酮處理后子宮組織中的鈣離子含量顯著（P<0.05）下降。不同處理對子宮內(nèi)膜細胞和子宮組織中基因的表達量影響為：孕酮處理后Cabp-d28k、CA和OPNmRNA在子宮中的表達量顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）下降，OVA、Clu和OC17mRNA的表達量顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）升高；孕酮受體拮抗劑處理后TRPV6mRNA的表達量顯著（P<0.05）下降，OVA、OVO、Clu和OC17mRNA的表達量顯著（P<0.05）或極顯著（P<0
6、.01）升高。與對照組和拮抗劑處理相比，孕酮處理后蛋殼內(nèi)膜層和乳突層變厚，纖維直徑和結(jié)節(jié)直徑變大，乳突間隙和纖維間隙變小，差異均達到顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）水平，且孕酮處理后Cabp-d28k、OVA、OVO以及OPN等基因的表達量變化與蛋殼超微結(jié)構(gòu)有相關(guān)性；免疫組化和WesternBlotting分析結(jié)果表明，Cabp-d28k和Ovalbumin蛋白在不同處理組的子宮中均有表達，但Cabp-d28k蛋白在孕酮處理組中的表達量低于對照組和孕酮受體拮抗劑處理組，Ovalbumin蛋白則
7、相反。結(jié)論：蛋殼鈣化初期孕酮顯著（P<0.05）抑制了Cabp-d28k和OPN在子宮中的表達，使蛋殼的乳突面積、乳突直徑和纖維間隙減?。辉型@著（P<0.05）促進了OVA和OVO的表達，使蛋殼的纖維徑和結(jié)節(jié)直徑增加；且使蛋殼內(nèi)膜層厚度和乳突層厚度增加。研究認為蛋殼鈣化初期孕酮可通過調(diào)控蛋雞子宮中與鈣化相關(guān)的基因和蛋白的表達，使蛋殼纖維內(nèi)膜層和乳突層結(jié)構(gòu)更致密，排列更有序，從而使增加蛋殼強度。本研究為蛋殼鈣化時鈣沉積的機制的進一步研究提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：蛋雞，孕酮，蛋殼鈣化，鈣轉(zhuǎn)運蛋白，基
8、質(zhì)蛋白IAbstractObject:Weinvestigatetheeffectofprogesteroneontheexpressionsofproteinsandgenesinthechickenuterus,andresearchthemechanismofcalciumdepositionintheearlystageofcalcification.Methods:Inthepresentstudy,chickene
