關(guān)于豬卵母細(xì)胞孤雌激活技術(shù)概述

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1、關(guān)于豬卵母細(xì)胞孤雌激活技術(shù)概述摘要：孤雌激活隨著近年來體細(xì)胞克隆技術(shù)的興起而成為了又一研究熱點(diǎn)，而豬由于其生理結(jié)構(gòu)與人的相似性，所以其卵母細(xì)胞的孤雌激活更具有特別的研究?jī)r(jià)值，文章就孤雌激活的概念、機(jī)理、方法、影響因素等方面全面論述了豬卵母細(xì)胞孤雌激活的研究概況。關(guān)鍵詞：豬；卵母細(xì)胞；孤雌激活孤雌生殖(parthenogenesis)作為一種生殖方式在無脊椎動(dòng)物和低等脊椎動(dòng)物中較為常見，在魚類、兩棲類、爬行類和鳥類等脊椎動(dòng)物中也存在孤雌生殖的現(xiàn)象，但哺乳動(dòng)物在自然狀態(tài)下則未見有孤雌生殖現(xiàn)象。孤雌生殖的關(guān)鍵是提高卵

2、母細(xì)胞的激活率，通過人工模擬自然條件下卵母細(xì)胞的自然激活機(jī)理(卵母細(xì)胞的自發(fā)激活和精子穿入引起卵母細(xì)的激活)創(chuàng)造更多更好的激活方法，從而進(jìn)一步提高卵母細(xì)胞的孤雌激活率，一直是孤雌生殖研究的重點(diǎn)內(nèi)容，具有重要的研究?jī)r(jià)值。一方面可把卵子活化的各個(gè)過程(如皮質(zhì)反應(yīng)、減數(shù)分裂的恢復(fù)和發(fā)育到第l次卵裂過程)分開來研究，對(duì)于闡明哺乳動(dòng)物卵激活過程的信號(hào)偶聯(lián)過程、細(xì)胞周期阻滯的恢復(fù)、受精機(jī)制和發(fā)育機(jī)理具有重要意義。另一方面，卵母細(xì)胞激活是細(xì)胞核移植和胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmicsperminjectio

3、n，ICSI)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，卵母細(xì)胞的激活率的高低直接關(guān)系到ICSl技術(shù)的效率，目前，卵母細(xì)胞激活率很低是核移植和胞質(zhì)內(nèi)單精子注射成功率低的重要原因之一。同時(shí)，由于豬的生理結(jié)構(gòu)與人的諸多相似，被醫(yī)學(xué)界認(rèn)為是人類器官移植的最佳提供者，且豬的數(shù)量充足，妊娠周期短，產(chǎn)仔多，容易飼養(yǎng)，取材容易，充分滿足臨床需要，未來在生物醫(yī)學(xué)方面有潛在的重要應(yīng)用前景，這使豬的孤雌激活技術(shù)成為近年來的研究熱點(diǎn)，這對(duì)于畜牧業(yè)和生物醫(yī)學(xué)具有重大理論和實(shí)踐意義。1.卵母細(xì)胞孤雌激活的概念　　孤雌生殖是指無雄性配子的任何作用，由雌性配子產(chǎn)生個(gè)體的

4、繁殖[1]。孤雌生殖的關(guān)鍵是提高卵母細(xì)胞的激活率，而卵子在自然條件下的激活是由精子穿入刺激引起的，即由于精子的進(jìn)入啟動(dòng)MⅡ期卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，這一過程稱為卵母細(xì)胞的激活。卵母細(xì)胞的激活分為3種，即為自發(fā)激活(常見于行孤雌生殖的動(dòng)物和老化卵母細(xì)胞)、精子激活(自然條件下有性生殖動(dòng)物的精卵結(jié)合)和人工激活。通過人工模擬自然條件下卵母細(xì)胞的激活機(jī)理，在體外也可以通過各種理化刺激使處于MⅡ期的卵母細(xì)胞激活，即為卵母細(xì)胞的人工孤雌激活。2.卵母細(xì)胞孤雌激活的機(jī)理　　自然條件下，受精引起卵母細(xì)胞激活后的主要事件包括細(xì)胞質(zhì)內(nèi)

5、游離Ca2+濃度的升高、皮質(zhì)顆粒胞吐和阻止多精受精、減數(shù)分裂的恢復(fù)和第二極體(PB2)釋放、雌性染色體轉(zhuǎn)化為雌原核、精子去致密轉(zhuǎn)化為雄原核、雌雄原核內(nèi)DNA復(fù)制、雌雄原核在卵子中央部位相互靠近、核膜破裂及染色質(zhì)混合等。鈣離子振蕩和鈣波是激活過程的初始信號(hào)，隨后引起包括皮質(zhì)顆粒(CG)釋放、細(xì)胞內(nèi)pH改變、母源mRNA的補(bǔ)充等一系列激活反應(yīng)，最終導(dǎo)致原核形成、DNA合成起始和卵裂。卵母細(xì)胞MⅡ期的維持與高水平的成熟促進(jìn)因子(MPF)活性有關(guān)[2]。MPF的活性是由對(duì)Ca2+非常敏感的細(xì)胞靜止因子(CSF)來維持的

6、，CSF的作用是抑制停滯于MⅡ期卵母細(xì)胞內(nèi)的CyclinB的降解。卵母細(xì)胞受精或人工激活后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增加，使CSF的活性消失，cyclinB被降解，從而引起MPF的活性降低或消失，細(xì)胞離開M期，完成減數(shù)分裂并進(jìn)行卵裂。不論是受精激活或人工激活MⅡ期卵母細(xì)胞都會(huì)發(fā)生的Ca2+順時(shí)性升高，也就是說Ca2+的震蕩引發(fā)的Ca2+是卵母細(xì)胞激活的特征性事件，由此通過相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑并最終引發(fā)相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化反應(yīng)，從而啟動(dòng)發(fā)育。3.常見卵母細(xì)胞孤雌激活的方法卵母細(xì)胞孤雌激活方法可歸納為物理刺激、化

7、學(xué)刺激和物化聯(lián)合處理3類。物理刺激包括機(jī)械刺激、溫度刺激以及電刺激處理等；化學(xué)刺激包括酶刺激、離子載體處理、麻醉劑處理以及蛋白磷酸化抑制劑處理等；物化聯(lián)合處理有電刺激聯(lián)合A23187(Ca2+載體)；乙醇(EH)聯(lián)合放線菌酮(CHX)、離子霉素(Ion)聯(lián)合6-DMAP(6-二甲氨基嘌呤)等。目前，電刺激是應(yīng)用最廣泛的卵母細(xì)胞激活方法，此外乙醇、鈣離子載體、6-DMAP、CHX(放線菌酮)等也用于卵母細(xì)胞激活。對(duì)于豬卵母細(xì)胞的激活而言，有使用化學(xué)試劑激活卵母細(xì)胞的報(bào)道，但大多學(xué)者仍傾向于使用電激活，并認(rèn)為電激活

8、足以使豬卵母細(xì)胞充分激活。但是采用單純電刺激激活的卵母細(xì)胞孤雌胚大多為單倍體，影響其發(fā)育。因此，為了提高孤雌激活胚胎的發(fā)育率，常常將電刺激與化學(xué)激活聯(lián)合起來，使得孤雌激活胚胎為二倍體。3.1物理激活　　物理激活方法中，機(jī)械刺激和溫度刺激，因其操作繁瑣，穩(wěn)定性和重復(fù)性差，且孤雌激活率偏低，較少被人們采用。相對(duì)而言，電刺激激活方法因簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，且集激活和融合為一體，而被廣