利多卡因?qū)Τ赡甏笫蠛ｑRCA1區(qū)錐體細(xì)胞L型Ca2單通道特性的影響

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1、第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文利多卡因?qū)Τ赡甏笫蠛ｑRCA<,1>區(qū)錐體細(xì)胞L-型Ca<'2+>單通道特性的影響姓名：張慶國(guó)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床麻醉學(xué)指導(dǎo)教師：徐世元20030527利多卡因?qū)Τ赡甏笫蠛ｑRCAl區(qū)錐體細(xì)胞L．型Ca2+單通道特性的影響研究生張慶國(guó)導(dǎo)師徐世元教授(第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科廣州510282)中文摘要一、目的：局麻藥系臨床麻醉最為常用的藥物，其所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)毒性驚厥為臨床上常見(jiàn)的并發(fā)癥，但目前對(duì)局麻藥驚厥的發(fā)生機(jī)制尚無(wú)滿意的解釋。本實(shí)驗(yàn)研究的目的是運(yùn)用膜片鉗技術(shù)

2、(patchclamDtechnique，PCT)的細(xì)胞貼附模式(Cell—attached)記錄方法，從單通道水平研究不同濃度利多卡因?qū)Τ赡甏笫蠛ｑRCAl區(qū)錐體細(xì)胞上L．型Ca”通道活動(dòng)的影響，以探討局麻藥毒性驚厥的中樞分子機(jī)理，進(jìn)而為臨床預(yù)防和救治局麻藥中毒驚厥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、方法：(一)采用酶加機(jī)械分離的方法，急性分離出成年大鼠海馬CA．區(qū)錐體細(xì)胞。大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，置入用純02飽和的低溫(0。C--4。C)低鈣緩沖液中，用振動(dòng)切片機(jī)切成400gm厚的冠狀腦片，將腦片置于孵育液中，通95

3、％02—5％C02混合氣體孵育l～6h。取出腦片于低鈣緩沖液中分離出海馬CAl區(qū)，切成lI砌2的小片，置于1～1．59／L的鏈霉蛋白酶液中酶解30～45min。酶解后的腦片用低鈣緩沖液清洗三遍，移入裝有2ml低鈣緩沖液的試管中，用三根尖端經(jīng)火拋光的Pasteur吸管梯度吹打使細(xì)胞游離。吹打好的細(xì)胞懸液靜置3min，吸取中層滴加于蓋玻片上，粘附10～15min。倒掉未粘附上的組織碎片和細(xì)胞，將蓋玻片放入加有1～2“浴槽液的記錄浴槽中即可進(jìn)行離子通道記錄。(二)采用膜片鉗技術(shù)的細(xì)胞貼附記錄模式進(jìn)行離子通道

4、記錄。匯錄采用細(xì)胞貼附(Cell—attached)記錄模式，微電極用電極拉制器拉制，入水電阻為6～9MQ，封接電阻大于5GQ。放大器反饋電阻設(shè)置為50GD，低通濾波頻率為lkHz，采樣頻率5kHz，間隔5s。用去極化脈沖對(duì)ca2+通道進(jìn)行激活，用pCLAMP(version8．0，AxonInstruments)Clampex程序進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，用Fetchan和pSTAT對(duì)離子通道進(jìn)行分析。首先鑒定和觀察海馬神經(jīng)元上L一型ca”通道的基本電生理學(xué)和藥理學(xué)特性。利多卡因經(jīng)微量加樣器依次加入浴槽液中，濃

5、度逐次累加形成6個(gè)終濃度(0、2、4、8、16、32Ixg／m1)，記錄不同濃度下利多卡因?qū)一型ca”單通道活動(dòng)的影響，資料存入硬盤(pán)以備分析和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處彈。三、結(jié)果：(一)分離出的成年大鼠海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征保存完好，符合實(shí)驗(yàn)條件的細(xì)胞游離、呈錐形、活性好、貼壁好，整個(gè)細(xì)胞胞膜清晰、胞體透亮、胞漿均勻一致并保存有較長(zhǎng)的軸突、樹(shù)突，軸突可長(zhǎng)達(dá)200um以上?；钚约?xì)胞還保存了L．型Ca2+通道的基本電生理學(xué)和藥理學(xué)特性，易于鑒別。(二)低濃度利多卡因(2、4“∥戚)對(duì)L．型Ca2+通道的活動(dòng)無(wú)

6、明顯影響；濃度達(dá)8、16“g／rm時(shí)，L一型Ca2+通道平均開(kāi)放時(shí)間由對(duì)照6．10±0．25ms分別增加到8．12±0．30ms(P<0．05)、7．71±0．54ms(P<0．05)，濃度達(dá)32“g／ml時(shí)，開(kāi)放時(shí)間反而降至4．89±0．22ms(P<0．05)；濃度為8、16、32I．tg／ml時(shí)，整體平均電流分別為0．804±0．092pA(P

7、放概率增加(P<0．05)，隨著濃度的進(jìn)一步增加(32肛g／m1)，開(kāi)放概率又逐漸減小(P<0．05)?？傮w．4。而言，隨著濃度的增加利多卡因?qū)一型Ca2+通道的影響表現(xiàn)為先興奮后抑制的作用。四、結(jié)論：(一)成功地建立了一種簡(jiǎn)單、快速、可靠的適用于膜片鉗單通道記錄的成年大鼠海馬CA．區(qū)錐體細(xì)胞的急性分離方法。分離出的海馬錐體細(xì)胞不僅形態(tài)學(xué)特征保存完好，并且運(yùn)用PCT的細(xì)胞貼附模式鑒定并記錄了L一型ca2+通道的單通道電活動(dòng)情況，觀察了Nifedipine和BayK8644對(duì)通道電活動(dòng)的影響，其結(jié)果與

8、相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致，(二)利多卡因?qū)Τ赡甏笫蠛ｑRCAl區(qū)錐體細(xì)胞L．型Ca2+單通道活動(dòng)的影響呈濃度依賴性的特點(diǎn)：較低濃度時(shí)(2、4I_tg／m1)無(wú)明顯影響；當(dāng)增加到一定濃度時(shí)(8、16ktg／m1)，表現(xiàn)出顯著的興奮性作用；當(dāng)濃度進(jìn)一步增加到32p∥ml時(shí)，則表現(xiàn)為明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度利多卡因引起的CNS功能變化與L．型Ca2+通道功能活動(dòng)的變化有關(guān)。提示L一型ca”通道功能活動(dòng)的變化可能與局麻藥的中樞神經(jīng)毒性機(jī)制有關(guān)。關(guān)鍵詞：大鼠