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《豬瘟病毒HLLY地方株E2基因在畢赤酵母中的表達及高效表達條件的探索》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、東北農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文豬瘟病毒HL-LY地方株E2基因在畢赤酵母中的表達及高效表達條件的探索姓名：滿朝來申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：李一經(jīng)2003.5.1摘要豬癔楚危害葬豬韭的主要傳染癀，為了得到大鬣的豬瘟瘸毒特異慌診斷抗原，并試閏在真拔細胞中犬量表達豬瘟病毒特有的免疫保護性抗原，即E2囊膜糖蛋白．為進一步鍘釜猿癌亞摹挺疫茁有效蘸茨本痰羹定綦鶿。搴試驗善次斃爨7我黧遺方分裹株HL，LYE2囊膜糖蛋白基因，將該基因整合到肇赤酵母襲達系統(tǒng)，使該基因獲得了高效表達，并在此基礎(chǔ)上探索了不同外界條件對表達量的影響。／主要結(jié)果如下：攝瓣基鑫瘁蠢發(fā)表鮑豬瘟
2、褒毒糙基因謦列及孥券酵母表達載缽pPIC9靜多競隆位點序列，利用Oligo和Primer5．0簿軟件設(shè)計并合成～對引物，以提取豬瘟病毒HL．LY株總RNA為模扳，應(yīng)用RT．PcR技術(shù)，擴增锝到E2基因。將該基因片段兜嵬隆到pMm8-T載律上．并避章予了酶弼、PCR鑒定和溪l癢努析，陽性重維菔粒命名為下．E2。運用DNAMAN軟件將測序結(jié)果島國內(nèi)外已發(fā)表的豬瘟病毒Alfort株，Brescia株，SHIMEN揀，C揀，C—V—LZ揀，GS—LT檬翻GS—LX揀靜E2基囂壘繆列和E2基因主要抗原睡序列(23bp--545bp)的核營酸和羝基酸序，《進行了黼源性比較
3、，E2蒸因全序列核苷酸的同源性分別為：99．20％，95．44％，96．51％，95．53％，89．12％，78．66％，78。23％主要撓蒙區(qū)棱蜚酸豹曩滾性分裂為；98+90％，95。05％，96。70％，96，15％，95．42％，82．42％，83．15％。E2基因全序列氨基酸的同源性分別為：98．93％，95．98％，97．32％，95．71％，89．54％。83．16％，83．42％；主鬻抗原區(qū)氨基酸的間源性分別為：98．35％，95．05％，97．25％，95．60％，95。05％+87，36％，88。弱％。結(jié)繁襲明E2基因主要抗原區(qū)和全序列均具有
4、較高的保守性，與國內(nèi)外代表毒株Alfort株，Brescia株，SHIMEN株，C揀同源性較贏，瓣與國內(nèi)其他毒株C。V-LZ株，GS—LT棣，GS．LX株同源健較低，說晴我國都分選區(qū)豬瘟病毒存在E2基因突變棒。將重組質(zhì)粒T-E2的E2基因酶切后，溉克隆到襲達載體pPIC9上，經(jīng)酶切和PCR鑒定，愈名為pPIC9一E2。重組表達載髂pPIC9．E2綴SalI酶切線性純囂，電轉(zhuǎn)純整臺到畢赤酵母GSll5基因組上，經(jīng)PCR鑒定和PCR產(chǎn)物測穿分析，陽性轉(zhuǎn)化予命名為GSll5·pPIC9-E2·將GSl15一pPIC9-E2在30℃條鋅下振蕩培養(yǎng)，疆1％夔攀醇誘導，猿
5、瘟瘓毒我融合蛋白獲得了表達，表達量為o．349／L。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS．PAGE和Westem．blot和Dot．ELISA分析，確定其表達的融合騷自分子擻太小為50．54ku，且具有天然蛋白的抗原特異惶。通過對表達條件如pH值、通氣量、誘導甲醇終濃度、培養(yǎng)基的選擇等條件的探索，可確定豬瘟筑毒HL*LY揀囂2基因表達豹理想條{孛為：最適pH馕在4．0-6。0之闖，最遁培養(yǎng)萋為MM培養(yǎng)基，最佳誘導的甲酵終濃度為1％，加大道氣量時表達量較妣∥％：’關(guān)鍵詞豬瘟病毒：E2基因；(克??；表達：畢赤酵母。，一。。，；—一!一。?！斝袜蝮蝥F鯊鎏圣一．。。。。。．一，。。
6、，。Expression程囂2GenefromClassicalSwineFeverVirusHL-LYIsolateinPichiapastorisandExploringforItsExpressionConditionsAbstractClassicalSwineFever(CSF)isoneofmajorcontagiousdiseasesinpigbreedingindustryInordertogainmassivediagnosticantigenCSFV，andlargescaleofCSFVspecificmajorprotectiveant
7、igenprotein(E2envolopeglycoproteimineucaryoticcells，whicharepreparedintosubunitvaccineforeffectiveproventionagainstCSF．E2genefromCSFVHL-LYisolatewasclonedandexpressedinPichiaPastorisexpressionsystem，moreovef'conditionswereexplorerdforexpressingtheE2envelopeglycoprotein．Theresultsmsh
8、owedasfollows．Accor
