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《PCV2ORF2基因的表達、純化及小鼠免疫效力研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)是近年來發(fā)現(xiàn)的動物病毒之·，該病毒與豬的多種疾病綜合癥有關(guān)，特別是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥。該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查表明在許多國家都廣泛存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。研究表明在主要的幾個開放閱讀框中，ORFl相對保守，主要編碼病毒的復(fù)制蛋白，而ORF2相對變異較大，是主要的免疫原性基因，也是PCV2亞單位疫苗研制的主要對象。為了了解PCV2在我國的流行現(xiàn)狀以及研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防治，本課題對PCV2基
2、因工程疫苗進行了探索研究，主要研究內(nèi)容如下：以河南省豬圓環(huán)病毒陽性仔豬的脾臟為材料，提取病毒DNA，根據(jù)已報道的PCV2序列設(shè)計合成2對引物，應(yīng)用PCR技術(shù)，擴增出豬圓環(huán)病毒野毒株ORF2基因和去信號肽基因命名為CORF2，然后將其克隆于pUCⅡI．T載體中，構(gòu)建克隆載體pUCm-T／CORF2，pUCm-T／ORF2，并進行核苷酸序列測定。1．對CORF2，ORF2基因進行序列分析后，分別酶切pUCm—T／CORF2，pUCm—T／ORF2得到ORF2和CORF2基因，與原核表達載體pET-3
3、2a(+)、pET一41a(+)相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a／CORF2、pET-41a(+)／ORF2。2．重組質(zhì)粒pET一32a／CORF2，pET一41a(+)／ORF2轉(zhuǎn)入宿主菌BLgold(DE3)中，用異丙基硫代一13-D-半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)表達，用SDS-PAGE電泳和Westernblotting檢測蛋白表達情況及表達蛋白活性。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET一32a／CORF2能在大腸桿菌中高效表達，其表達的蛋白以包涵體形式存在，表達產(chǎn)物的分子量為38KD左右，與理論推測的
4、蛋白分子量一致。經(jīng)western_blotting及建立的間接ELISA方法檢測，表達的ORF2蛋白可被豬圓環(huán)病毒陽性血清所識別。pET-41a(+)／ORF2也能在大腸桿菌中表達，表達效果不是很好，經(jīng)換載體與表達菌后仍不能高效表達，最后放棄?！?．收集重組質(zhì)粒pET-32a／CORF2誘導(dǎo)表達的菌液，超聲波破碎分離包涵體，TritonX-100和NaCl分別洗滌包涵體，用8mol／L尿素溶解包涵體后經(jīng)Ni—BPA親和層析法純化，獲得了純度較高的目的蛋白，其純度可達．80％。每孔以lOOng純化
5、的目的蛋白包被酶標板進行ELISA檢測，結(jié)果顯示，純化蛋白與PCV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。4．表達產(chǎn)物經(jīng)純化后，以每只小鼠0．1mg、0．2mg、0．4mg分成3組分別免疫5周齡左右的雌性小鼠，然后用ELISA檢測免疫小鼠血清中特異性抗體以及中和抗體的產(chǎn)生情況，結(jié)果表明，純化的重組蛋白能使小鼠產(chǎn)生了抗豬圓環(huán)病毒的特異性抗體，從第7天開始產(chǎn)生抗體，第28天抗體水平達到最高，抗體可維持7周以上，并具有良好的安全性，為進一步研究豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒，包涵體，Ni．BPA親
6、和層析，小鼠免疫效應(yīng)，基因工程疫苗IIABSTRACTPorcineeircevirustype2isoneofthenewanimalvil'吣e8inrecentyears．．Itisassociated誦thvariousdiseasesyndromesinpigs，especiallypost-weaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)．ThisdiseaseisfirstemergedinwesternCanadain1991．Cfinieals
7、ignsincludeprogressiveweightloss，respiratorydisorders，fever,pallorandjaundice．PMWSiswidespreadinmanycountriesbypathologicalandserologicalsurveyandhasaseriouseconomicimpactontheswineindustryworldwide．PCV2hastwoprimaryopenreadingframe(ORFs)，ORFlandORF2
8、，encodedRepproteinandCapproteinrespectively．TheCapproteinofPCV2asantigenicpropertiesdemonstrated，constitutesanexcellentcandidateforvaccination．TofindouttheprevalenceofPCV2in0111"countryanddevelopsafeandeffectivevaccinetopreventandcontrolPCV2infection
