水貂綠膿肝菌flic基因表達及其對小鼠免疫效力的研究

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1、ExpressionoffliCGeneandImmuneEvaluationInMiceInducedbyRecombinantProteinofMinkPseudomonasAeruginosaThesissubmittedtongdaoAgriculturalUniversittjInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy——一Author：YangPeipei(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：Prof．Shan

2、Hu，Prof．QinXiaobingQingdao．ChinaJune，2012獨創(chuàng)性聲明啪洲咖咖帥啪咖砌硼蛐Y2332691本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：扔碚磚時間：劫J羔年／月；p日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解青島農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送

3、交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：．扔如鋤時間：Ⅵ，土年鈿弓口日導(dǎo)師簽名：時間：協(xié)12年；月；口日水貂綠膿桿菌fliC基因表達及其對小鼠免疫效力的研究摘要綠膿桿菌可以引起人和多種動物感染發(fā)病，是一種危害人類健康及畜牧業(yè)發(fā)展的重要條件致病茵。一直以來，人們希望能找出預(yù)防和控制該茵感染的有效方法。近年來發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌具有廣譜耐藥性，其對大多數(shù)防腐劑和抗菌藥物表現(xiàn)為天然或獲得性多重耐藥，所

4、致感染可供選擇的有效抗菌藥物越來越少，使臨床治療的難度不斷增加。此外綠膿桿菌血清型眾多，不同血清型茵株其免疫原性不盡相同，給綠膿桿菌疫苗的研制帶來很大困難。有實驗證明fliC基因是所有綠膿桿菌共同具有的基因，其編碼的鞭毛蛋白是重要的表面抗原，具有種屬特異性，且不同血清型之間具有相同的鞭毛蛋白免疫原，能產(chǎn)生交叉保護作用。鑒于綠膿桿菌感染的普遍性，以及鞭毛基因的特點，本研究克隆和表達f1iC基因，并結(jié)合小鼠免疫模型分析其免疫原性，探討綠膿桿菌鞭毛蛋白疫苗對于綠膿桿菌感染的保護作用，對構(gòu)建綠膿桿茵fliC基因工程疫苗和從根本上防止綠膿桿菌的感染具有重要意義．首先對山東地區(qū)分離

5、的不同來源綠膿桿菌進行鞭毛抗原基因分型，以確定貂源綠膿桿菌的主要流行血清型。分析比較OenBank登錄的綠膿桿菌fliC基因序列，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計分型引物，以提取的細菌基因組DNA為模板，擴增fliC基因的部分片段，根據(jù)片段大小確定鞭毛類型(A型或B型)，對兩種類型代表株的擴增產(chǎn)物進行測序分析，驗證PCR分型方法的可靠性，最終得出山東地區(qū)貂源綠膿桿茵的流行血清型為H抗原基因A型。其次對兩種類型代表株fliC全基因進行克隆與序列分析。根據(jù)Genbank登錄的A型和B型fliC基因序列分別設(shè)計引物，在引物的上下游分別引入酶切住點BamHI和肋oI，擴增兩種鞭毛類型代表株P(guān)A

6、SD01和PASD03的fliC(A型fliCll85bp、B型fliCl467bp)全基因，按常規(guī)方法克隆到pMDl8-T載體，制備重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿茵DH5Q中，用藍白斑實驗初步篩選可疑陽性克隆?？梢申栃钥寺∵M一步進行特異PCR和酶切鑒定后對插入片段進行測序，并將測序的序列與已知序列進行同源性比較。最后對A型鞭毛菌f1ic基因進行原核表達，并初步分析其免疫原性及免疫保護性。將測序鑒定正確的A型fliC基因從pMDl8-T-fliCA陽性克隆中純化、回收，與表達載體pGEX一6P一1連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5o【中，得到基因工程茵，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的陽性克隆

7、命名為pGEX-6P-I-f1iCh。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進行IPTG誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE與Westernblot鑒定，可產(chǎn)生相對分子量約為66KD的表達產(chǎn)物，表明成功構(gòu)建了f1iC蛋白的重組表達系統(tǒng)。以誘導(dǎo)表達的融合蛋白免疫家兔，制備兔抗鞭毛蛋白免疫血清，通過試管凝集試驗測定抗體效價在1：640-1：1280之間，證明表達的融合蛋白具有較高的免疫原性，可作為亞單位疫苗的候選抗原。通過小鼠主動保護試驗，計算小鼠存活率為90％以上，證明表達的鞭毛蛋白具有很好的的免疫保護性。關(guān)鍵詞：水貂；綠膿桿菌；