沉默乙酰肝素酶對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移影響的體外研究

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1、中文摘要目的采用RNA干擾技術探討沉默乙酰肝素酶(heparanaseHPa)對人胃癌細胞株SGC一7901轉(zhuǎn)移和移動能力的影響。方法根據(jù)人HPa基因序列設計4個小干擾RNA(smallinterferingRNA,sirtNA)靶位點(HPal521、HPal324、HPal085、HPallll),并構建了4個針對靶位點的一個載體編碼一個短發(fā)夾狀RNA(shRNA)質(zhì)粒表達載體,同時合成了1個陰性對照質(zhì)粒表達載體(shNC)和1個陽性對照質(zhì)粒表達載體(shhGAPDH),采用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株SGC一7901,用Western—blot和RT—PCR檢測轉(zhuǎn)染前后乙酰肝素酶

2、蛋白和mRNA表達的變化,選出對乙酰肝素酶抑制效果最顯著的質(zhì)粒作為研究對象,利用其轉(zhuǎn)染細胞SGC一7901,并用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞,擴增培養(yǎng),應用Transwell小室侵襲試驗和劃痕損傷實驗分別研究轉(zhuǎn)染前后細胞SGC一7901侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化。結果脂質(zhì)體介導質(zhì)粒HPal521、HPal324、HPal085、HPallll轉(zhuǎn)染細胞后,轉(zhuǎn)染后細胞乙酰肝素酶mRNA的表達量(HPamRNA光密度值與相應內(nèi)參之比)分別為0.83s0.03、0.78±0.05、0.36s0.01、0.67±0.04,乙酰肝素酶蛋白表達量(HPa蛋白表達光密度值與相應內(nèi)參之比)分別為0.87±0.

3、01、0.76±0.03、0.38±0.01、0.69s0.03D質(zhì)粒HPal085對乙酰肝素酶的抑制作用較其它質(zhì)粒顯著,質(zhì)粒HPal085轉(zhuǎn)染SGC7901細胞后并用C,418篩選后,在Transwell小室侵襲試驗中,轉(zhuǎn)染組與正常對照組侵襲的細胞數(shù)分別為44±15.22和289.9±18.11,轉(zhuǎn)染組侵襲細胞數(shù)較正常對照組顯著減少(P

4、詞RNA小分子干擾乙酰肝素酶SC,C一7901TheEffectofHeparanaseGeneSilenceontheInvasionandMetastasisofhumangastriccarcinomacellinVitroAbstractObjectiveToevaluatetheeffctofsilenceheparanaseontheinvasivenessinhumangas—triccarcinomacelllineSGC一7901usingRNAinterferenceteehnolog.MethodsFourtarge—tedlocations(HPal521、H

5、Pal324、HPal085、andHPalI11)weredesignedandfourplasmidvectorsexpressingshorthairpinRNA(shRNA)tartgetingHPawereconstructedaccordingtotranscriptionRNAlocationofhumanHPagenesequenceanddesigningprincipleofsmallin—terferenceRNA(siRNA).Alsoanegativeandapositivecontrolplasmidvectorswerecon-stmcted.Theyw

6、eretransfectedintohumangastriccarcinomaSGC一7901ceilsmediatedbycationicliposomelipofectin:HPamRNAandproteinexpressionlevelsweredetectedbyRT—PCRandWesternblotting,respectively.TheplasmidthatremarkablyinhibitedheparanaseWasdecided.Aftertransfectedwiththisplasmid,positivecellcloneswereselectedwithG

7、418andamplefied.Stabletransfectedceilswereobtainedandroutinelymaintainedinselectionmediumtoavoidovergrowthofnon—transfectedcells.Invasiveandmobilitypowerwereevaluatedbe—foreandaftertransfactionbythemembranceinvasionculturesystem(T

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