乙酰肝素酶的表達(dá)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系

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1、乙酰肝素酶的表達(dá)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系【摘要】目的探討乙酰肝素酶（HeparanaseHpa）在肝癌中的表達(dá)及其與肝癌臨床病理特征的關(guān)系。方法分別采用RTPCR和免疫組織化學(xué)法檢測HpamRNA及Hpa蛋白在肝細(xì)胞肝癌、癌旁肝組織及肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)。結(jié)果肝癌HpamRNA的表達(dá)顯著高于癌旁及正常肝組織（P<0.05），肝癌組織中HpamRNA的表達(dá)與腫瘤包膜受侵、門脈受侵、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、TNM分期、復(fù)發(fā)有關(guān)（P<0.05）。肝癌Hpa蛋白的表達(dá)與包膜和門脈是否受侵、Edmondson分級、有無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、TNM分期及復(fù)發(fā)有關(guān)（P<0.05）。結(jié)論HpamRNA及蛋白在

2、肝癌中高表達(dá)，并與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】肝細(xì)胞肝癌乙酰肝素酶侵襲轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)　　0引言　　乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）是1999年克隆分離出的一種葡糖苷酸內(nèi)切酶[1]。它可以降解硫酸乙酰肝素(hearansulfate，HS)，破壞細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜，并促進(jìn)腫瘤新生血管生成，使腫瘤細(xì)胞實現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移。我們運用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法對HpamRNA及Hpa蛋白在肝細(xì)胞肝癌、癌旁肝組織及肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，探討其與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。1資料與方法　　1.1一般資料　　43例肝癌和癌旁標(biāo)本來自我院2001年1月～2002年6月手術(shù)切除并

3、經(jīng)病理證實的肝細(xì)胞肝癌患者，癌旁組織為距腫瘤2cm處肝組織。另取手術(shù)治療的良性疾病的正常肝組織10例作對照。標(biāo)本切除離體后一份立即投入液氮中，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?，另一份?0％的福爾馬林固定。病人隨訪2年以上，其中23例復(fù)發(fā)，1例死于其他疾病。本組病例男性36例，女性7例。年齡36～72歲，平均52.7歲；HBsAg陽性者37例。病理學(xué)分級根據(jù)Edmondson方法，分期按國際抗癌聯(lián)盟于1997年提出的TNM分期方案。　　1.2主要試劑　　Trizol試劑（美國GibcoBRL公司），DNTPs、AMV、TaqDNA聚合酶由華美公司提供，內(nèi)參照及隨機(jī)引物由上海生工生物工程公司合成。

4、Hpa兔抗人多克隆抗體購自SantaCruz公司，SP試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC7721細(xì)胞、BEL7402細(xì)胞由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫提供。　　1.3細(xì)胞培養(yǎng)方法　　用RPMI1640培養(yǎng)基在含有5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC7721和BEL7402細(xì)胞，常規(guī)傳代，用0.25％的胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心10min（1000r/min），10mol/LPBS洗細(xì)胞兩次后，收集細(xì)胞用于提取總RNA。　　1.4總RNA提取　　參照Trizol試劑說明書提取組織及細(xì)胞總RNA，然后在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳

5、，將凝膠移至紫外透射儀下，在300nm紫外光線照射下進(jìn)行觀察，驗證RNA的完整性，并在紫外分光光度儀上測260nm和280nm兩個波長的吸光度，進(jìn)行RNA的定量?！　?.5半定量RTPCR檢測　　Hpa引物序列上游為5'TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC3'，下游為5'GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC3'，其擴(kuò)增片段長度為585bp。以βactin作為內(nèi)參照，其引物序列上游為5'ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG3'下游為5'CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC3'，其擴(kuò)增片段長度為

6、838bp。Hpa的反應(yīng)條件為反轉(zhuǎn)錄37℃60min；預(yù)變性94℃5min；變性94℃1min；復(fù)性57℃1min；延伸72℃1min。進(jìn)行35個循環(huán)后進(jìn)一步延伸72℃5min。取10μl產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，通過凝膠掃描儀（美國FOTODYNE公司）進(jìn)行cDNA電泳條帶和光量子強(qiáng)度分析，將Hpa與βactin比值作為Hpa表達(dá)水平的參數(shù)?！　?.6免疫組織化學(xué)染色方法及結(jié)果判定　　標(biāo)本常規(guī)甲醛固定取材、脫水、石蠟包埋后做4μm連續(xù)切片，按SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒染色步驟進(jìn)行，Hpa表達(dá)陽性為細(xì)胞漿染成棕黃色，在光鏡下觀察5個高倍視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)≤10％為

7、陰性表達(dá)，>10％為陽性表達(dá)。　　1.7統(tǒng)計學(xué)處理　　采用t檢驗及χ2檢驗，由SPSS10.0軟件進(jìn)行處理。　　2結(jié)果　　2.1Hpa在不同組織中的表達(dá)　　43例肝癌組織中有26例（60.5%）HpamRNA陽性表達(dá)，43例癌旁組織中僅2例（4.7%）陽性表達(dá)；免疫組織化學(xué)染色顯示25例肝癌組織Hpa蛋白表達(dá)陽性，癌旁組織有5例表達(dá)陽性；10例正常肝組織均未見表達(dá)；肝癌與癌旁、正常肝組織的HpamRNA及蛋白表達(dá)差異有顯著性（