白腐菌Pleurotus+ostreatus漆酶及對蒽醌染料和堿木素脫色的研究

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1、白腐茁Pleurotusoslrealtts漆酶及對蒽醍染料和堿木素脫色的研究摘要本論文以白腐菌木質(zhì)素降解酶為研究對象，從十二株白腐菌中篩選產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力強的菌株，利用層析技術(shù)將木質(zhì)素降解酶分離純化，并進一步了解該酶的基本酶學性質(zhì)和特性，用于蒽醌染料SN4R的脫色研究，同時考察了產(chǎn)漆酶自腐菌對造紙堿木素的脫色能力。所試自腐菌在限氮條件下未發(fā)現(xiàn)有錳過氧化物酶和木素過氧化物酶的生成，主要產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶為漆酶。其中產(chǎn)漆酶能力最強的是側(cè)耳(Pleurotusostreatus324)；次之為側(cè)耳(Pleurotus

2、ostreatusJ青島黑，杏鮑菇(Pleurotuseryngii)，側(cè)耳(Pleurotusoslreatus)5526；產(chǎn)漆酶能力較低的有香菇(Lentinusedodes9608)，以及側(cè)耳(Pleurotusoslreatus)中的792、G1、G5和鮑魚菇；而雜色云芝(Polyporusversicolo，)，灰管層孔(Fomeslignosus)，草菇(Votvariellavolvcea)在此條件下不產(chǎn)漆酶。在富氮培養(yǎng)條件下，未發(fā)現(xiàn)有木質(zhì)素過氧化物酶的生成，主要木質(zhì)素降解酶為漆酶和錳過氧化物酶。在富

3、氮培養(yǎng)條件下自腐菌產(chǎn)漆酶能力明顯低于限氮條件下產(chǎn)漆酶能力，高濃度的氮對漆酶生產(chǎn)有抑制作用。糙皮側(cè)耳(戶leurotusostreatus324)在限氮條件下產(chǎn)漆酶能力較強，本論文研究了該菌的產(chǎn)漆酶能力，并進行了酶學性質(zhì)和應用性研究。白腐菌真菌Pleurotusostreatus324最佳產(chǎn)漆酶條件為：靜置條件下培養(yǎng)，溫度為30℃，培養(yǎng)基初始pH為5，三角瓶裝液量為20ml／250tal。在所有測試碳源中，纖維二糖、阿拉伯糖為最佳碳源；在氮源中，有機氮要優(yōu)于無機氮，如蛋白胨、酵母膏、酒石酸銨、尿素都是漆酶生產(chǎn)的良好氮

4、源，當培養(yǎng)基C／N>IO：1即高碳低氮培養(yǎng)條件下，有利于漆酶的形成；產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加0．5mmol／L濃度的不同金屬離子，其中Ca”，Cu“有助于漆酶的產(chǎn)生；添加誘導劑ABTS(0．5．1mM／L)對漆酶的活性影響最明顯，與對照相比可提高漆酶酶活5倍，約為410U／ml。該酶產(chǎn)量明顯高于國內(nèi)外同類文獻報道，白腐菌Pleurotusostreatus324是漆酶的優(yōu)良生產(chǎn)者，具有很高的實際應用價值。白腐菌Pleurotusostreatus324漆酶，經(jīng)三步層析分離，純化為電泳級，純化倍數(shù)為26．5倍，回收率為38．

5、3％。該漆酶單個亞基分子量為56．5kD，自然分子量為56kD。該酶在醋酸緩沖液中最適反應pH為3．5，最適反應溫度為65。C，在醋酸緩沖液(pH5．0)中，反應溫度低于50。C時，漆酶非常穩(wěn)定；該漆酶能氧化ABTS和各種酚類化合物，尤其是對對位和鄰位甲氧基取代酚的氧化能力強，羥基取代酚次之，而對氨基取代酚、阿魏酸和焦醅酚的氧化能力相對較弱；疊氮化鈉對該漆酶有強烈的抑制作用。與其它真菌漆酶相比，無論是在分子量大小上，還是在酶學性質(zhì)上都明顯不同，可初步斷定Pleurotus大連理工大學博士學位論文ostreatus3

6、24漆酶為一新的真菌漆酶。漆酶是一種含銅多酚氧化酶，可催化酚類化合物和芳香胺的氧化，在小分子介體物質(zhì)存在下，漆酶氧化范圍可進～步擴大。蒽醌染料活性艷藍SN4R可被該粗漆酶(30U／m1)直接脫色，脫色最佳pH值為4．0，40℃為最佳脫色溫度，脫色時間為12小時，脫色率為55％，但酶活與染料脫色率不呈正比關(guān)系。經(jīng)一系列SN4R脫色的對比實驗，發(fā)現(xiàn)純漆酶和小分子物質(zhì)ABTS分別單獨使用時，都不能使蒽醌染料SN4R脫色，當純漆酶中添加小分子介體物質(zhì)ABTS時，可使SN4R脫色；顯然蒽醌染料SN4R不是漆酶底物，小分子還原

7、介體可介導漆酶與非酶底物染料之間的氧化作用，而使染料脫色。小分子介體物質(zhì)ABTS、對一甲氧基酚、藜蘆醇的添加，有助于染料脫色率的提高以及脫色時間的縮短，添加一定濃度的對一甲氧基酚或藜蘆醇后，染料SN4R2小時的脫色率可達80％以上。自腐菌分泌胞外氧化酶一木素降解酶。這類氧化酶底物專一性不強，除降解木質(zhì)素外還降解大量的芳香族污染物。首先觀察了四種白腐菌Pieurotuseryngii，Polyporusversicolor，Pleurotusostreatus和Fomeslignosus在限氮和富氮培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)產(chǎn)

8、木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的能力，由于Pleurotusostreatus和Pleurotuseryngii產(chǎn)酶能力較強，用于堿木素的降解脫色效果較好，二者在限氮條件下11天對堿木素降解脫色率為65％和72％。對于Pleurotusostreatus324來說，0．69／LCa2+有助于該菌體生物量的增加，對其產(chǎn)酶影響不明顯；lOmg／LMn2+有助