豆豉纖溶酶的純化、特征及其RGDS載酶脂質(zhì)納米粒構(gòu)建與評(píng)價(jià)

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1、摘要現(xiàn)在心腦衄管栓塞性疾病日益嚴(yán)重地危害著人們的健康，因此研究開發(fā)低成本、高效、擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新一代預(yù)防和治療心腦血管栓塞性疾病的功能食品和溶栓劑，具有重大的社會(huì)午

2、l經(jīng)濟(jì)效益。本課題研究了中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的纖溶特性，并從中國傳統(tǒng)豆豉中分離、篩選出六株高產(chǎn)纖溶酶的芽孢桿菌，其中以來源于“八寶豆豉”的DC。2。3纖溶活力為最高，該苗株被初步鑒定為B．subtilis。DCm。。在48h進(jìn)入產(chǎn)酶高峰期，通過正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)擬合DCl2_33產(chǎn)纖溶酶與營養(yǎng)因素水平的回歸方程，并通過極值分析優(yōu)化出培養(yǎng)

3、基配方；正交政計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化Dc一。產(chǎn)纖溶酶最優(yōu)條件，在此優(yōu)化的條件下其產(chǎn)酶量達(dá)到780U／ml(尿激酶單位，纖維蛋白平板法測(cè)定)。DC。：。發(fā)酵液經(jīng)連續(xù)凝膠層析純化，得到電泳純的纖溶酶，其最終純化倍數(shù)和回收率分別達(dá)到34．6倍和13．0％，純化酶蛋白比活力達(dá)到15494．9U／mg。該酶在還原和非還原條件下SDS．PAGE電泳分析均為單一條帶，且酶的酰胺活力完全被絲氮酸蛋白酶抑制劑PMSF和SBTI所抑制，金屬離子絡(luò)合劑EDTA、EGTA以及金屬離子對(duì)該酶活力幾乎沒有影響，因此該酶為不含一s—s一的

4、單鏈絲氨酸蛋白酶，我們命名為“FibrinolyticSubtilisinFS33(豆豉纖溶酶)”。SubtilisinFS33的生化特征和酶動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，該酶在底物特異性、分子量、N．末端序列等多方面都與已知的微生物源纖溶酶不同，因此是一種新型、潛在的溶栓酶。SubtilisinFS33分子量為30KDa，等電點(diǎn)D，為8．7--．0．2，且絲氨酸(含羥基)和色氨酸(含吲哚基團(tuán))是其酶活性中心或位于酶活性中心附近。FS33在pH7．12的較寬范圍內(nèi)性質(zhì)較穩(wěn)定，但酸性條件酶活力迅速下降；Sub

5、tilisinFS33對(duì)不同的酰胺鍵也表現(xiàn)出不同的活力，其最有效的人工合成底物是N—Succ—Ala-Ala—Pro—Phe—pNA。該酶的纖溶活力明顯高于傳統(tǒng)的纖溶酶Urokinase和SubtilisinCarlsberg。通過體外雨I動(dòng)物血栓模型體I勺試驗(yàn)等，研究評(píng)價(jià)了SubtilisinFS33對(duì)機(jī)體凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的影響及其作用機(jī)制。在溶栓機(jī)制上，SubtilisinFS33在缺乏內(nèi)源性溶血因子的情況下，仍能溶解【lI】栓纖維蛋白，表現(xiàn)出直接降解血栓纖維蛋白能力，并且FS33可馓活內(nèi)源

6、性的纖溶酶原，產(chǎn)生活性纖溶酶，因此SubtilisinFS33同時(shí)具有直接和間接的溶栓作用。另外，SubtilisinFS33還可降解失活凝血酶和胰激肽釋放原酶等其它重要凝血因子。為提高纖溶酶SubtilisinFS33的生物利用度和組織器官歸巢趨向性，探討了血小板膜纖維蛋白原受體配基RGDS肽作為趨【血栓靶向劑的可行性，并構(gòu)建了SubtilisinFS33RGDS脂質(zhì)納米粒載酶系統(tǒng)。硫酸銨梯度法制備的RGDS．載酶脂質(zhì)體的粒徑在50—150am左右，屬于納米級(jí)單室脂質(zhì)體，其活性包封率30％左右，

7、其導(dǎo)向物RGDS肽的含量約為93ug／ml。SubtilisinFS33經(jīng)脂質(zhì)體包被后其溫度、極端pH和模擬人：[腸液的耐受能力較未經(jīng)脂質(zhì)體包被的酶有一定提高，并減緩了體內(nèi)的釋放速度，延長了體內(nèi)存留時(shí)間。不J司劑量SubtilisinFS33、RGDS一載酶脂質(zhì)體給予受試大鼠，其APTT、PT、TT等都明顯延長(尸<0．05，，

8、詞：豆豉纖溶酶，發(fā)酵，純化，生化特征，靶向RGDS一載酶脂質(zhì)體AbstractCardiovasculardiseases，suchasacutemyocardialinfarction，ischemicheartdisease，andhighbloodpressurearetheleadingcausesofdeathintheworld．Amongthedifferenttypesofcardiovasculardiseases，thrombosisisoneofthemostwidelyoc

9、curringdiseasesinmodemlife．Therefore，tocreateonelowcost，higheffectiveandownself-determinationpropertyfightnextgenerationfunctionalfoodandnewthrombolyticagentsareofgreatsignificance．ThisstudyfocusedonthefibrinolyticpropertyoftraditionalChinesef