骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對家兔股骨頭缺血性壞死的治療作用

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1、莢文縮寫14河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師(或指導(dǎo)小組)的指導(dǎo)下，由本人獨(dú)立完成。本學(xué)位論文研究所獲的研究成果，其知識產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文，第一署名單位為河北醫(yī)科大學(xué)，試驗(yàn)材料、原始數(shù)據(jù)、申報的專利等知識產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則，承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。研究生簽名互汜；批導(dǎo)師簽名：弘逶鼉學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)簽名：D習(xí)年妒2徊研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研冗成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝等內(nèi)容外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫

2、的研究成果，指導(dǎo)教師對此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫，文責(zé)自負(fù)。研究生躲王∥朱鈰虢弘氍紗鑼年壙月刀日中文摘要骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對實(shí)驗(yàn)性家兔股骨頭缺血性壞死的治療作用摘要股骨頭缺血性壞死(avascularorischemicnecrosisoffemoralhead，砧蝦H)是一種常見的骨關(guān)節(jié)疾病，與多種致病因素有關(guān)，可能存在多種發(fā)病機(jī)制。近年來有些研究認(rèn)為，ANFH可能是一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchamalstemcells，BMSCs)減少性疾?。灰延醒芯繄蟮里@示，運(yùn)用自體紅骨髓移植治療ANFH，取得了一定的療效。但是，尚缺乏利用培養(yǎng)

3、的BMSCs移植，對ANFH治療作用的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。BMSCs具有高度增殖和多向分化潛能，經(jīng)定向誘導(dǎo)可分化為骨、軟骨、脂肪、肌、肌腱、神經(jīng)細(xì)胞等。目前，BMSCs已成為骨組織工程技術(shù)研究中，最為重要的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)就BMSCs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，及其移植對ANFH的治療作用，進(jìn)行觀察和分析：旨在探討B(tài)MSCs移植，對ANFH的治療作用、修復(fù)機(jī)理以及合理的治療方法。一、BMSCs向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)目的：BMSCs具有高度增殖和多向分化潛能；目前，已成為骨組織工程技術(shù)中最為重要的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對BMSCs的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，誘導(dǎo)其

4、向成骨細(xì)胞的方向分化，利用光鏡和電鏡，觀察其細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。方法：從成年新西蘭大耳白兔髂后上嵴處抽取骨髓，種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液為含20％胎牛血清DMEM液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，傳代密度為1×106／cm2。第3代細(xì)胞培養(yǎng)，部分加入誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)劑為10mmol／L13．甘油磷酸鈉，10{mmol／L地塞米松，50mg／L維牛素C。培養(yǎng)2周后，誘導(dǎo)和未加誘導(dǎo)的BMSCs，分別進(jìn)行堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BⅧ)和鈣化結(jié)節(jié)檢測，并用光鏡、掃描和透射電鏡，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果：全骨髓培養(yǎng)后，BMSCs呈放射狀克隆集落貼壁生長。通過消中文摘要化傳代后，細(xì)胞呈長梭形

5、分散排列，少量細(xì)胞呈星形，胞漿豐富，常有1～2個細(xì)胞核，位置居中。堿性磷酸酶呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，鈣化結(jié)節(jié)和BMP免疫組織化學(xué)染色均呈陰性反應(yīng)。經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞生長旺盛，形體飽滿，體積逐漸增大，呈魚群樣排列。堿性磷酸酶、鈣化結(jié)節(jié)和BMP免疫組織化學(xué)均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。掃描電鏡觀察顯示，BMSCs呈長梭形，大部分細(xì)胞為單核。經(jīng)過向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)后，胞體增大，細(xì)胞呈現(xiàn)雙核增多現(xiàn)象。透射電鏡觀察顯示，BMSCs間無明顯連接結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核不規(guī)則。經(jīng)過誘導(dǎo)后的細(xì)胞，細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙連接，細(xì)胞器更為豐富，并出現(xiàn)大量的基質(zhì)小泡、髓樣結(jié)構(gòu)和空泡狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核常呈圓形或橢圓形。結(jié)論：BMSCs可通過全骨髓培

6、養(yǎng)、細(xì)胞貼壁牛長篩選法，存體外進(jìn)行大量擴(kuò)增；在體外可通過定向誘導(dǎo)，向成骨細(xì)胞分化。BMSCs在體外經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞間出現(xiàn)典型的縫隙連接，細(xì)胞器更為豐富，并出現(xiàn)大量的基質(zhì)小泡、髓樣結(jié)構(gòu)和空泡狀結(jié)構(gòu)，這些變化可能是誘導(dǎo)后成骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征。二、BMSCs移植對實(shí)驗(yàn)性家兔ANFIt的治療作用目的：砧盯H可能有多種發(fā)病機(jī)制；近年來有些研究認(rèn)為，砧師H可能是一種BMSCs減少性疾病。本實(shí)驗(yàn)采用體外擴(kuò)增的BMSCs移植，治療實(shí)驗(yàn)性家兔ANFH，旨在探討其治療作用和修復(fù)機(jī)制。方法：48只成年新西蘭大白兔，隨機(jī)分成A、B、C、D四組，每組12只。A組為單純造模組，B組為髓芯減壓組

7、，C組為自體BMSCs移植組，D組為同種異體BMSCs移植組。全部采用液氮冷凍股骨頭負(fù)重區(qū)的方法，制作ANFH的實(shí)驗(yàn)動物模型。四組實(shí)驗(yàn)動物，分別于術(shù)后2、4、6、8周，各處死3只動物，進(jìn)行股骨頭標(biāo)本的大體解剖學(xué)觀察、X．線檢查以及組織學(xué)觀察。結(jié)果：采用液氮冷凍法，成功制備了ANFH的動物模型，所有標(biāo)本在組織學(xué)上，表現(xiàn)出骨壞死與修復(fù)過程。存X．線上，呈現(xiàn)股骨頭密度增高、骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂和軟骨下囊性變，個別標(biāo)本還出現(xiàn)了塌陷現(xiàn)象和類似骨性關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)。B組標(biāo)本在2周時，鉆孔區(qū)邊緣出現(xiàn)較多的成骨細(xì)胞，并有新骨形成，鉆孔的中央部空虛，至8