細菌的分離、接種和培養(yǎng)

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1、實驗五細菌的分離、接種和培養(yǎng)目的要求實驗原理實驗材料實驗步驟操作規(guī)范示例作業(yè)一、目的要求掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥等）中分離和純化微生物的方法和原理；倒平板；細菌純種分離：稀釋混合平板分離法、稀釋涂布平板分離法和平板劃線法；接種技術；無菌操作技術；在自然界中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起的，為了生產(chǎn)和科學研究的需要，當我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離出它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)物，這種獲得純培養(yǎng)物的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得純種的微生物，一般根據(jù)該微生物營養(yǎng)或培養(yǎng)特點(微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條

2、件)，或對某種抑制劑的耐受性不同，或對某種環(huán)境條件要求不同，從而制作或設置一些選擇性培養(yǎng)基，或選擇性培養(yǎng)條件，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或劃線法分離，純化該微生物，直至得到該純種菌株。二、實驗原理三、實驗試劑與器材土壤樣品（環(huán)境樣品）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；無菌試管、無菌三角瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿；超凈工作臺（一）稀釋混合平板法四、實驗步驟1.土壤稀釋液的制備①稱取土樣10g，放入盛90ml無菌水三角瓶中，振蕩15～20分鐘，使微生物細胞分散，靜置約20～30秒，即成10-1的土壤懸液。②另取裝有9ml無菌水的試管，編號為10-2、1

3、0-3、10-4、10-5、10-6，用無菌吸管吸取10-1土壤懸液lml，加入編號10-2的無菌試管中，吹吸三次，使之混合均勻，即成10-2的土壤稀釋液。再用另一支吸管吸取10-2試管中的土壤稀釋液1ml，加入編號10-3的無菌試管中，輕輕搖動，使之混合均勻，即成10-3的土壤稀釋液，一定要每次更換一支無菌吸管（連續(xù)稀釋）。同法依次分別稀釋成10-4、10-5和10-6等一系列稀釋度菌懸液。2.平板制作將無菌培養(yǎng)皿編上10-3、10-4、10-5號碼，每一號碼設三個重復，用1ml無菌吸管按無菌操作要求吸10-5稀釋液各1ml，分別放入編號10-5的三個培養(yǎng)皿中

4、。同法吸取10-5稀釋液各1ml，分別放入編號10-4的三個培養(yǎng)皿中。再吸取10-3稀釋液各1ml，分別放入編號10-3的三個培w1養(yǎng)皿中。然后在9個培養(yǎng)皿中分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，整個操作過程應嚴格按照無菌操作。3.培養(yǎng)與移植待平板完全冷凝后，將平板倒置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48小時，檢查分離結果。將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的斜面上，然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查

5、是否是單一的微生物，若有其它雜菌混雜，就可再一次進行分離、純化，直至獲得純培養(yǎng)。（二）稀釋涂布平板法此法與稀釋混合平板法基本相同，無菌操作也一樣，所不同的是先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化，在火焰旁注入培養(yǎng)皿，搖勻后制成平板，然后用三支1ml無菌吸管分別由10-4、10-5、10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.2ml對號放入已寫好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，然后分別倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)后，再挑取單個菌落，直至獲得純培養(yǎng)。（三）平板劃線分離法制備土壤稀釋液傾注平板培養(yǎng)挑菌落接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種

6、圈7.接種鋤8.小解剖刀移接斜面常用的接種方法劃線接種點接種穿刺接種涂布接種液體接種注射接種斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞純化（平板劃線法）倒平板——劃線——培養(yǎng)——挑菌落——純種（純培養(yǎng)）平板劃線分離的方法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法五、微生物實驗技術操作規(guī)范示例（一）斜面接種無菌操作技術（二）倒平板及平板劃線接種（一）斜面接種無菌操作技術(二）倒平板及平板劃線接種（三）平板劃線接種：六、作業(yè)1.簡述無菌操作過程中的注意點。2.擬出從土壤中分離細菌的主要實驗步驟。3.如

7、何檢驗平板上某個單菌落是不是純培養(yǎng)？4.培養(yǎng)時為什么要將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？一、視頻演示二、取自己做的培養(yǎng)皿，觀察，并作圖三、挑取菌落，進行革蘭氏染色，初步判別革蘭氏陰性或陽性菌四、將自己的培養(yǎng)皿、試管清洗干凈，放入抽屜五、作業(yè)：從土壤中分離細菌的主要實驗步驟。